ATOX1缺失通过促进铜死亡诱发阿尔茨海默病记忆障碍

《Journal of Advanced Research》：ATOX1 deficiency induces memory impairment via promoting cuproptosis in Alzheimer’s disease

　　

阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，临床特征为进行性认知功能下降和记忆障碍。铜稳态紊乱与阿尔茨海默病密切相关，过量铜会加剧氧化损伤、蛋白质聚集和认知缺陷。铜死亡（cuproptosis）是一种与线粒体损伤相关的新型细胞死亡方式，由细胞内铜超载引起。然而，铜死亡在阿尔茨海默病发病机制中的 involvement 尚不明确。铜伴侣蛋白ATOX1对维持铜稳态至关重要。本研究旨在探讨ATOX1和铜死亡在阿尔茨海默病进展中的作用，并阐明其潜在的调控机制。研究人员分析了人类阿尔茨海默病脑组织数据库和样本，以及APP/PS1小鼠模型和Aβ处理的HT22细胞。技术方法包括蛋白质组学、免疫荧光、蛋白质印迹（Western blot）、电子显微镜和行为学测试。在体内外利用腺相关病毒（AAV）载体和shRNA操控ATOX1表达。采用染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因实验研究转录调控。结果显示，ATOX1在人类阿尔茨海默病患者脑组织、APP/PS1小鼠和Aβ处理细胞中显著降低。小鼠中ATOX1下调引起铜积累、线粒体损伤和铜死亡的分子特征，包括硫辛酰化蛋白（lipoylated protein）聚集和铁硫（Fe-S）簇蛋白丢失，导致神经元死亡和记忆障碍。这些铜死亡标志物在人类阿尔茨海默病患者脑组织和APP/PS1小鼠中也得到证实。重要的是，ATOX1上调可逆转铜死亡、改善突触缺陷，并挽救APP/PS1小鼠和Aβ处理细胞中的记忆障碍。此外，研究人员鉴定出Runx1是Aβ暴露条件下ATOX1的转录抑制因子，揭示了一种将淀粉样病理与铜调控异常直接联系起来的新机制。研究结论表明，Aβ诱导的Runx1对ATOX1的抑制驱动铜超载和铜死亡，促进阿尔茨海默病的神经退行性变和认知缺陷。ATOX1是阿尔茨海默病有前景的治疗靶点。

阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，以进行性认知功能下降和记忆障碍为临床特征，其主要病理标志为淀粉样蛋白-β（Aβ)斑块沉积和由过度磷酸化Tau蛋白组成的神经纤维缠结。随着全球人口老龄化趋势加速，阿尔茨海默病的患病率急剧上升。铜离子作为必需微量元素，参与中枢神经系统氧运输、能量代谢、抗氧化防御及神经递质合成代谢等重要生物学过程，但异常积累的铜离子会促进Aβ淀粉样聚集和Tau蛋白过度磷酸化，加剧神经炎症和氧化损伤，最终导致阿尔茨海默病患者出现明显认知缺陷。

铜死亡是一种依赖于细胞内铜异常积累的新型细胞死亡方式，与线粒体损伤密切相关，不同于已知的凋亡、焦亡（pyroptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）和铁死亡（ferroptosis）。在铜死亡通路中，细胞内过量铜离子直接与三羧酸（TCA）循环中的硫辛酰化蛋白结合，导致硫辛酰化蛋白异常聚集并干扰铁硫（Fe-S）簇蛋白稳定性，从而引起蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。具体而言，铁氧还蛋白1（FDX1)促进Cu²⁺还原为Cu⁺，随后与硫辛酰化二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）或二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移酶（DLST）结合并诱导其寡聚化，加剧蛋白质毒性应激并触发铜死亡。此外，硫辛酰合成酶（LIAS)在促进蛋白聚集和抑制Fe-S簇形成中发挥关键作用，导致线粒体蛋白质毒性应激和铜死亡。近年研究表明，铜死亡可能参与多种铜积累相关疾病，包括威尔逊病、癌症以及阿尔茨海默病等神经退行性疾病。

抗氧化蛋白1（ATOX1)作为铜转运ATP酶（ATP7A和ATP7B)的伴侣蛋白，其表达对调控铜稳态、介导线粒体抗氧化和细胞内氧化应激至关重要。ATOX1缺失导致铜外排受损，细胞内铜含量显著增加且分布异常。ATOX1作为分子变阻器，平衡生理铜信号与铜依赖性细胞死亡。在创伤性脑损伤中，ATOX1上调可通过调节铜水平和增强线粒体抗氧化能力保护神经；在帕金森病动物模型中，ATOX1多肽注射可抑制多巴胺能神经元丢失。最新研究显示，阿尔茨海默病小鼠和果蝇脑内铜含量分别接近正常对照的3.5倍和4倍，提示阿尔茨海默病动物模型脑内同样存在铜稳态失衡和铜离子异常积累，但ATOX1是否介导阿尔茨海默病中铜的异常积累及其在认知障碍中的确切机制尚待阐明。

研究人员首先利用Alzdata数据库分析发现，在269例阿尔茨海默病患者和271例正常老化对照的20个GSE数据集中，ATOX1表达显著降低，而其他铜转运分子（CTR1、COX17、CCS、ATP7A、ATP7B)无显著变化。AlzCode和GSE28146数据集进一步显示ATOX1表达随阿尔茨海默病严重程度进展性下降，且与简易智力状态检查量表（MMSE)评分呈正相关。免疫荧光染色和蛋白质印迹证实阿尔茨海默病患者脑神经元中ATOX1水平降低，8月龄APP/PS1小鼠海马中ATOX1水平同样降低并伴有铜离子过度积累。性别分析显示该病理变化无性别差异。时序分析揭示APP/PS1小鼠从4至12月龄海马铜呈进行性积累，8月龄时与野生型对照出现显著差异，此为金属稳态失衡的关键拐点；而Atox1 mRNA水平在6和8月龄时已显著下调，与铜积累初期相吻合，提示ATOX1缺失是铜介导神经毒性和随后认知下降的早期启动因素。

为阐明ATOX1在脑铜稳态和认知功能障碍中的作用，研究人员将AAV介导的ATOX1 shRNA（sh-ATOX1)或对照载体注射于3月龄C57BL/6小鼠海马，一月后进行病理形态学实验和行为学测试。蛋白质印迹和免疫荧光证实sh-ATOX1小鼠ATOX1表达显著降低。尼氏染色和NeuN免疫染色显示ATOX1敲除后海马区神经元大量丢失。透射电子显微镜分析揭示sh-ATOX1小鼠海马突触前活性带缩短、突触后密度（PSD）厚度降低，提示突触完整性受损。高尔基染色进一步显示ATOX1下调小鼠海马树突复杂度降低、树突交叉数和树突长度减少，树突棘密度显著下降。新物体识别（NOR)测试中，对照组小鼠对新异物体有显著偏好，而sh-ATOX1小鼠不能区分新异与熟悉物体，识别指数和辨别指数显著降低。Morris水迷宫（MWM)测试中，sh-ATOX1小鼠训练期寻找隐藏平台潜伏期增加，记忆探测试验中首次穿越平台位置时间增加、穿越平台次数减少、目标象限停留时间缩短，游泳速度无差异表明运动功能未受影响。恐惧条件化测试中，sh-ATOX1小鼠在训练后2小时和24小时僵直时间和僵直百分比均显著降低，表明短期和长期恐惧记忆均受损。这些结果共同证明ATOX1缺失导致学习记忆缺陷。

研究人员进一步探究ATOX1缺失是否通过铜死亡介导神经元丢失。透射电子显微镜显示ATOX1敲除显著诱导线粒体肿胀、空泡化、嵴排列紊乱稀疏，伴显著线粒体碎裂（长径比1-1.5），均为铜死亡的特征性形态学标志。同时线粒体活性氧（ROS)产生升高、ATP水平显著降低，线粒体铜含量显著增加。蛋白质印迹显示线粒体硫辛酰化靶蛋白DLAT、DLST、二氢硫辛酰赖氨酸残基（2-甲基丙酰基）转移酶（DBT)和甘氨酸裂解系统H蛋白（GCSH)水平降低，而DLAT和DLST寡聚化状态显著增加，其硫辛酰化水平显著减弱。免疫荧光显示ATOX1下调促进线粒体中DLAT寡聚体增加。Fe-S簇蛋白（乌头酸酶2（ACO2)、LIAS、琥珀酸脱氢酶[泛醌]铁硫亚基（SDHB)、FDX1)在sh-ATOX1小鼠海马中显著减少，表明线粒体电子传递链严重破坏。这些线粒体结构崩溃、硫辛酰化蛋白稳态受损和Fe-S簇蛋白丢失的一致性观察结果，强烈支持ATOX1缺失通过铜死亡触发神经元死亡。

为确立铜在此病理过程中的因果必要性，研究人员采用铜螯合剂四硫代钼酸铵（TTM)进行挽救实验。结果显示TTM处理有效逆转了ATOX1缺失引起的细胞内铜水平升高，DLAT和DLST的异常寡聚化显著减弱，高分子量条带明显减少，单体形式部分恢复。这一直接挽救效应证实铜积累是硫辛酰化蛋白聚集及随后蛋白质毒性应激的主要驱动因素，为ATOX1缺失通过铜依赖性铜死亡机制触发神经损伤提供了决定性证据。

研究人员随后在阿尔茨海默病中验证铜死亡的突出特征。对人脑组织进行蛋白质组学分析，观察到硫辛酰化蛋白（DLAT、DBT、DLST)和Fe-S簇蛋白（ACO2、LIAS、SDHB)水平显著降低。免疫荧光检测显示阿尔茨海默病患者脑内线粒体DLAT显著聚集，提示阿尔茨海默病中铜死亡激活强烈。在8月龄APP/PS1小鼠中的实验与sh-ATOX1小鼠观察结果一致：硫辛酰化蛋白水平显著降低，DLAT和DLST寡聚化状态显著增加，其硫辛酰化水平显著减弱，海马免疫荧光显示线粒体DLAT寡聚体显著积累，Fe-S簇蛋白水平也降低。这些结果共同表明铜死亡是阿尔茨海默病的突出特征，可能在介导阿尔茨海默病铜代谢紊乱相关认知障碍中发挥关键作用。

研究人员进一步探究ATOX1上调是否能通过抑制铜死亡改善阿尔茨海默病认知功能。将AAV-ATOX1或其空载体对照注射于6月龄APP/PS1或野生型小鼠海马，两个月后进行检测。蛋白质印迹、免疫荧光和ELISA分析证实AAV-ATOX1处理成功提升ATOX1表达，同时减弱线粒体铜积累。ATOX1恢复显著逆转了铜死亡相关硫辛酰化蛋白（DLAT、DLST、DBT、GCSH)和Fe-S簇蛋白（ACO2、LIAS、SDHB、FDX1)的表达，DLAT和DLST的寡聚化显著减少，蛋白硫辛酰化增加。ATOX1上调显著减轻APP/PS1小鼠线粒体肿胀、空泡化和嵴紊乱/稀疏，明显逆转线粒体碎裂，同时显著降低线粒体ROS产生并恢复ATP生成。尼氏染色和NeuN免疫荧光显示ATOX1过表达不仅挽救铜死亡还增强神经元存活。电子显微镜和高尔基染色分析揭示ATOX1过表达显著增加突触前活性带长度和突触后密度厚度，增强树突复杂度（更多树突交叉和更长树突长度）和树突棘密度。NOR测试中，APP/PS1小鼠对新旧物体无显著偏好，而ATOX1上调显著挽救此损伤；ATOX1上调显著增强阿尔茨海默病小鼠识别指数和辨别指数。MWM学习期，AAV-ATOX1处理APP/PS1小鼠寻找平台潜伏期缩短；记忆期，这些小鼠平台穿越次数增加、目标象限停留时间百分比增加。游泳速度一致表明运动功能未受影响。恐惧条件化测试中，APP/PS1小鼠在2小时和24小时僵直行为显著减少，表明联合记忆受损；ATOX1过表达显著逆转这些认知缺陷，僵直时间和百分比均显著增加。这些发现共同证明ATOX1上调抑制铜死亡、改善突触功能并增强APP/PS1小鼠认知表现。

鉴于Aβ是阿尔茨海默病的核心病理标志，研究人员假设Aβ诱导的神经元死亡可能由ATOX1缺失驱动的铜死亡介导。用Aβ1-42处理HT22细胞后观察到ATOX1表达显著降低，伴线粒体铜积累增加和碘化丙啶（PI)阳性细胞增加，表明细胞死亡。铜死亡相关硫辛酰化蛋白和Fe-S簇蛋白水平显著降低，DLAT和DLST寡聚化显著增加，蛋白硫辛酰化减弱。在Aβ1-42处理HT22细胞中上调ATOX1表达后，线粒体铜水平显著降低，PI阳性细胞显著减少，DLAT和DLST蛋白单体水平显著升高，其在线粒体中的寡聚状态显著降低。为验证这些发现在人源细胞中的一致性，研究人员在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中进行平行实验，结果与HT22细胞一致：Aβ处理触发ATOX1水平下降和细胞内铜相应升高，驱动DLAT/DLST单体丢失和毒性寡聚体形成；而在SH-SY5Y细胞中过表达ATOX1显著逆转铜积累并抑制DLAT和DLST寡聚化。这些结果证明ATOX1缺失驱动的铜死亡参与阿尔茨海默病中Aβ诱导的神经元死亡。

研究人员进一步探究ATOX1下调的分子机制。8月龄APP/PS1小鼠和Aβ1-42处理HT22细胞中ATOX1 mRNA水平降低提示转录调控。利用JASPAR数据库筛选ATOX1启动子区转录因子结合位点，选择转录起始位点上游2000 bp序列，预测四个潜在转录因子：Ar、Creb1、Runx1和Pax5。其中Runx1 mRNA水平在不同年龄APP/PS1小鼠海马中显著上调，而Runx1发挥转录抑制因子功能。染色质免疫沉淀（ChIP)联合RT-PCR证实Runx1直接结合ATOX1启动子。荧光素酶报告基因实验显示，敲低Runx1增强ATOX1启动子活性，而过表达Runx1抑制其活性。蛋白质印迹显示，在Aβ1-42处理HT22细胞中，Runx1敲低促进ATOX1表达，而过表达Runx1抑制ATOX1表达。为阐明Runx1诱导的上游机制，研究人员关注转录激活因子GATA2，其已知结合Runx1 +23.5 kb增强子；值得注意的是，GATA2 mRNA水平在APP/PS1小鼠和Aβ处理HT22细胞中均显著升高，与Runx1表达增加相关。这些发现共同表明Aβ通过GATA2介导的Runx1诱导，触发Atox1转录沉默，Runx1直接抑制Atox1启动子。

讨论部分，研究人员指出铜稳态失调日益被认为参与包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病在内的神经退行性疾病的发病机制。铜异常积累对阿尔茨海默病的病理发展和认知障碍至关重要，但具体机制尚待阐明。本研究建立了ATOX1缺失、铜超载诱导的铜死亡与阿尔茨海默病认知下降之间的关键联系。ATOX1作为维持铜外排所必需的关键胞质铜伴侣蛋白，在阿尔茨海默病患者、APP/PS1小鼠和Aβ处理神经元中显著下调。ATOX1缺失导致细胞内铜积累、线粒体功能障碍和铜死亡，最终引起突触损伤、神经元丢失和认知障碍。恢复ATOX1表达可减轻这些病理特征，凸显其作为阿尔茨海默病治疗靶点的潜力。

ATOX1功能受损可能导致细胞质中铜异常积累，过量铜进入线粒体，产生ROS和线粒体空泡化。本研究证明ATOX1在阿尔茨海默病患者和模型小鼠中显著下调，直接与铜水平升高、突触/认知缺陷以及神经元/线粒体损伤加剧相关。在APP/PS1小鼠中恢复ATOX1水平不仅有效减轻神经元和线粒体损伤，还挽救突触功能和认知表现。值得注意的是，阿尔茨海默病患者ATOX1水平与MMSE评分之间的相关性进一步强调其临床相关性。这些发现将ATOX1确立为铜稳态的关键调节因子，将阿尔茨海默病中的铜超载与线粒体损伤和认知下降联系起来。

铜死亡特征为铜依赖性硫辛酰化蛋白聚集和Fe-S簇蛋白去稳定化，这与阿尔茨海默病患者脑损伤中观察到的线粒体结构损伤、ROS水平升高和ATP缺乏相一致。ATOX1上调可抑制APP/PS1小鼠铜死亡和线粒体功能障碍。定量蛋白质组学分析揭示人阿尔茨海默病组织中硫辛酰化蛋白和Fe-S簇蛋白水平降低，反映了ATOX1缺失诱导的铜死亡分子特征。铜死亡的分子特征也可能成为临床识别阿尔茨海默病的潜在诊断方法。值得注意的是，铜死亡依赖于FDX1介导的蛋白硫辛酰化，但硫辛酰化蛋白和FDX1同时降低似乎存在矛盾。当前模型提出两种非互斥机制解释铜死亡期间FDX1下调：FDX1在还原积累铜离子过程中的持续消耗导致其过度耗竭；以及铜诱导FDX1结构去稳定化，促进其蛋白酶体降解。

体外数据在Aβ处理HT22细胞中证实，ATOX1恢复直接减轻Aβ诱导的神经元死亡，强化其在阿尔茨海默病特异性病理中的作用。这些发现拓展了先前将铜超载与阿尔茨海默病中Aβ聚集和氧化应激相联系的研究，为铜稳态失调与神经元死亡之间提供了机制桥梁。具体而言，Aβ聚集抑制ATOX1表达，导致铜超载和铜死亡介导的神经元死亡，从而丰富了Aβ诱导认知障碍的理论框架。

虽然铜超载和ATOX1抑制与阿尔茨海默病相关，但上游调控机制此前不明。本研究鉴定出转录抑制因子Runx1是Aβ诱导ATOX1抑制的关键介导者。Aβ1-42寡聚体触发Runx1上调，Runx1结合ATOX1启动子沉默其表达，为铜积累和铜死亡创造允许环境。重要的是，ATOX1过表达挽救认知缺陷并恢复线粒体完整性，证明铜介导毒性的可逆性，突出新的治疗途径。

空间和时间分析确定ATOX1下调是阿尔茨海默病病理的广义、性别无关标志，跨越海马、内嗅皮层等易损区域。关键地，ATOX1在6月龄时的下降先于8月龄铜积累的显著差异，定义了ATOX1耗竭作为铜介导神经毒性早期启动因素的关键病理窗口。在此情境下，ATOX1不足触发不稳定铜的病理性积累，随后驱动ROS产生和硫辛酰化蛋白的蛋白质毒性寡聚化，标志着铜死亡通路的激活，最终导致神经元功能障碍和认知障碍。

研究结论全面证明铜死亡在阿尔茨海默病中的激活跨越人死后脑组织、动物模型和细胞系统。研究人员鉴定铜伴侣蛋白ATOX1为铜稳态的关键调节因子，其下调导致细胞内铜积累、线粒体功能障碍和认知下降。重要的是，恢复ATOX1表达减轻铜死亡、挽救线粒体完整性并改善突触和认知功能。此外，鉴定Runx1为Aβ暴露条件下ATOX1的转录抑制因子，揭示了一种直接将淀粉样病理与铜调控异常联系起来的新机制。简而言之，Aβ诱导Runx1抑制ATOX1，触发铜超载、铜死亡，最终导致神经元死亡和认知下降。这些发现不仅补充了最近在阿尔茨海默病模型和患者中脑铜升高的报告，而且通过将ATOX1确立为铜诱导神经元死亡的核心调节因子，显著推进了该领域。靶向ATOX1可能提供一种针对铜毒性的精确策略，避免系统性铜螯合相关的脱靶效应，从而为治疗阿尔茨海默病相关认知下降提供新途径。