丙型肝炎病毒相关肝细胞癌关键枢纽基因及通路作为潜在诊断生物标志物的研究

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Key hub genes and pathways associated with HCV-related hepatocellular carcinoma as potential diagnostic biomarkers

　　

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）感染是其重要危险因素。早期检测和识别可靠的分子生物标志物对于改善患者预后至关重要。本研究旨在通过整合生物信息学方法，系统识别与HCV相关HCC相关的关键枢纽基因和信号通路，以发现潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取了GSE69715（包含37例HCV-HCC患者和66例健康对照）和GSE62232（包含9例HCV-HCC患者和10例健康对照）两个数据集，使用GEO2R工具识别差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），筛选标准为校正P值<0.05且|logFC|≥1。通过Venny工具分析，共鉴定出421个共同DEGs，其中315个上调、106个下调。随后，研究人员利用DAVID数据库进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，并通过STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，基于度中心性（Degree）、中介中心性（Betweenness）和接近中心性（Closeness）等参数识别枢纽基因。最终，研究人员通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的RNA测序数据及基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA）平台对候选枢纽基因进行表达验证和预后分析，同时利用TIMER2.0数据库分析枢纽基因与肿瘤浸润免疫细胞的相关性，并通过药物-基因相互作用数据库（Drug-Gene Interaction Database, DGIdb）和DrugBank进行药物-基因相互作用分析。

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第三大癌症死亡原因，其中丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）感染是诱发该疾病的重要危险因素。据统计，约55%至85%的HCV感染者会发展为慢性丙型肝炎，其中20%至30%可能进展为肝衰竭或肝硬化，最终导致HCC的发生。尽管近年来治疗手段有所进步，HCV相关HCC的发病率和死亡率仍然居高不下，早期诊断对于改善患者预后至关重要。异常基因表达在HCC的发生发展中起着关键作用，而高通量生物信息学技术的发展为系统筛查疾病相关分子标志物提供了可能。在此背景下，研究人员开展了这项整合生物信息学研究，旨在识别HCV相关HCC的关键枢纽基因和通路，为早期诊断和治疗提供新靶点。该论文发表于《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：从GEO数据库获取HCV-HCC患者与健康对照的基因表达微阵列数据集（GSE69715和GSE62232），利用GEO2R进行差异表达基因分析；通过DAVID和Enrich数据库进行GO和KEGG富集分析；基于STRING数据库构建PPI网络，并使用Cytoscape进行网络拓扑分析和枢纽基因筛选；利用TCGA-LIHC队列的RNA-seq数据及GEPIA平台进行表达验证和Kaplan-Meier生存分析；通过Pearson相关性分析构建枢纽基因的共表达网络；借助TIMER2.0数据库进行肿瘤免疫浸润分析；利用DGIdb和DrugBank数据库开展药物-基因相互作用分析。

研究结果部分包含以下主要内容：

共同差异表达基因的鉴定：研究人员从GSE69715和GSE62232两个数据集中鉴定出421个共同DEGs，包括315个上调基因和105个下调基因，这些基因可能参与HCV相关HCC的发生发展。

GO和KEGG通路富集分析：421个共同DEGs主要富集于铜离子解毒、细胞对镉离子反应、生长负调控等生物学过程；细胞组分方面主要涉及细胞外外泌体（Extracellular Exosome）、含胶原蛋白的细胞外基质、细胞外区域和细胞外空间；分子功能方面主要包括单加氧酶活性、吡哆醛磷酸结合、D-甘露糖结合和血红素结合。KEGG通路分析显示这些基因主要参与代谢通路、矿物质吸收、视黄醇代谢和氨基酸生物合成等通路，提示代谢紊乱和细胞外成分改变在HCV相关HCC进展中具有重要作用。

PPI网络构建及枢纽基因识别：在421个共同DEGs中，313个基因成功映射到STRING数据库并纳入PPI网络分析。基于度中心性、中介中心性和接近中心性等参数，研究人员识别出80个枢纽基因，其中连接度最高的10个基因为ALB、CDK1、CCNB1、CCNB2、CCL2、CDKN3、TOP2A、CXCL12、BUB1B和CDKN2A。

枢纽基因在TCGA-LIHC队列中的验证：GEPIA分析显示，上述10个枢纽基因中，CDKN2A、CDK1、CCNB1和TOP2A在HCV-HCC肿瘤组织中显著上调表达（P<0.05）。在独立的TCGA-LIHC队列中进一步验证，这四个基因在肿瘤组织中均显著高表达（p<0.001），且Kaplan-Meier生存分析证实其高表达与患者总生存期缩短显著相关（p<0.05）。通过STRING数据库构建的PPI网络显示这些基因高度互联，可能作为HCC发展的关键调控因子。

枢纽基因共表达网络验证：基于TCGA数据的共表达分析显示，CCNB1、CDK1、CDKN2A和TOP2A与其他蛋白编码基因存在显著相关性（|r|>0.5, p<0.05），热图分析表明这些枢纽基因在共表达网络中具有显著的中心性地位，提示其潜在的调控重要性。

免疫浸润分析：通过TIMER2.0数据库分析发现，CDK1和CCNB1与髓系树突状细胞、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞呈强正相关，提示这些基因可能影响抗原呈递和适应性免疫应答；CDKN2A与髓系树突状细胞、CD8⁺ T细胞、M1型巨噬细胞和B细胞正相关，强调其在先天楼盘免疫调节中的潜在作用；TOP2A与树突状细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和B细胞显著相关。这些结果表明枢纽基因表达与关键免疫细胞浸润密切相关，暗示其与肿瘤免疫微环境的潜在关联。

药物-基因相互作用分析：DGIdb数据库检索显示，针对TOP2A的多种药物如盐酸多柔比星、盐酸米托蒽醌、依托泊苷、替尼泊苷、戊柔比星、右雷佐生、盐酸柔红霉素、依托泊苷磷酸酯、伊达比星和安吖啶等已获得FDA批准临床应用；而针对CDKN2A、CDK1和CCNB1的化合物大多处于研究或实验阶段，具有未来治疗开发潜力。

讨论部分，研究人员指出尽管HCC治疗有所进步，但其发病率和死亡率仍居高不下。本研究通过整合GSE69715和GSE62232数据集，识别出421个共同DEGs，其中CDKN2A、CDK1、CCNB1和TOP2A的过表达与HCV相关HCC不良预后相关。通过独立TCGA-LIHC队列验证，这些基因在肿瘤组织中一致上调且与总生存期降低相关，跨平台可重复性突出了其作为预后生物标志物的可靠性。研究人员强调，CDKN2A、CDK1、CCNB1和TOP2A均为细胞周期调控和细胞分裂的关键因子，其失调可能导致细胞不受控增殖进而促进肿瘤发生。文献表明，CDK1是哺乳动物细胞周期调控的关键激酶，其靶基因参与转录过程、染色体分离、细胞形态发生、DNA复制和基因组稳定性维持；CCNB1在G2期至有丝分裂转变中起关键作用，其敲低可显著降低HCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力；TOP2A参与DNA拓扑结构改变，其过表达与肿瘤增殖和侵袭性增加相关，可激活G2-M期转换并促进上皮-间质转化；CDKN2A则作为细胞周期抑制因子，在多种肿瘤中表达升高并与预后不良相关。免疫浸润分析表明这些枢纽基因与关键免疫细胞群体浸润密切相关，可能影响肿瘤免疫微环境，为免疫治疗提供潜在靶点。药物分析显示TOP2A已有多种FDA批准靶向药物，而针对CDKN2A、CDK1和CCNB1的药物尚处研究阶段。研究人员承认本研究仅为生物信息学分析，缺乏实验验证，建议未来通过RT-qPCR、蛋白质印迹等体外和体内实验进一步确认这些基因的功能角色。

研究结论部分指出：本研究通过整合生物信息学分析，识别出与HCV相关HCC相关的关键枢纽基因和通路。值得注意的是，CDKN2A、CDK1、CCNB1和TOP2A被突出显示为潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。这些基因的共同特征是作为细胞周期控制和细胞分裂的关键因子，其失调可能导致不受控的细胞增殖进而促进肿瘤发展。这些发现可能有助于改善早期检测、指导治疗策略并提高HCV相关HCC患者的临床结局。