USP5-c-MAF轴调控脊髓损伤治疗中自噬依赖性神经元铁死亡

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：USP5-C-MAF Axis Regulates Autophagy-Dependent Neuronal Ferroptosis in Spinal Cord Injury Therapeutics

　　

目的：脊髓缺血再灌注损伤（SCI）是一种导致运动功能受损的严重继发性损伤，给个人和社会带来沉重负担。因此，亟需新的治疗靶点和策略来应对这一挑战。方法：体内采用动脉瘤夹夹闭C57BL/6J小鼠左肾动脉下腹主动脉构建SCI小鼠模型，60分钟后移除动脉瘤夹恢复血流；体外采用原代神经元氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模拟SCI条件。采用CCK-8法检测细胞活力，蛋白免疫印迹（WB）、免疫荧光（IF）和透射电子显微镜（TEM）联合检测神经元死亡、自噬和铁死亡水平。免疫沉淀-质谱联用（IP/MS）和Co-IP技术用于鉴定和验证与USP5相互作用的蛋白。结果：SCI小鼠神经元出现显著铁死亡。USP5在SCI神经元中显著上调并介导神经元铁死亡。体外实验表明，USP5过表达促进神经元铁死亡，而USP5敲除则显著减少铁死亡，体内实验结果一致。值得注意的是，USP5表达上调显著增加神经元自噬体和自噬通量积累，这可能是USP5介导神经元铁死亡的潜在机制。进一步的IP/MS和Co-IP研究证实了USP5与c-MAF之间的相互作用。此外，蛋白免疫印迹分析显示，USP5通过其去泛素化酶活性增强c-MAF蛋白稳定性，从而激活自噬并促进神经元铁死亡。结论：总之，研究结果表明铁死亡与SCI之间存在密切关系。USP5通过去泛素化调节c-MAF表达，从而激活神经元自噬依赖性铁死亡，介导SCI进展。USP5可作为SCI的潜在治疗靶点。

## 一、研究背景与问题提出

脊髓缺血再灌注损伤（Spinal Cord Ischemia-Reperfusion Injury, SCI）是一种因脊髓血流短暂中断后恢复灌注而引发的严重神经系统疾病。灌注恢复阶段触发一系列复杂的细胞和分子事件，包括过度氧化应激、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）生成、局部及全身炎症反应激活，以及广泛的神经元凋亡或坏死。神经元存活是脊髓功能恢复的关键决定因素，其通过上调神经营养因子如神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）和脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF），促进突触重塑和环路重组，最终支持神经功能恢复。然而，广泛的神经元损伤可能导致再生能力下降，限制修复潜力。因此，在SCI期间保护神经元完整性对于改善功能预后和加速患者康复至关重要。

铁死亡（Ferroptosis）是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的调控性细胞死亡形式，其机制涉及谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPX4）失活、铁超载和抗氧化防御受损。虽然铁死亡最初在癌症和神经退行性疾病中研究，但近年来已成为中枢神经系统损伤的潜在贡献因素，包括SCI，尽管其确切作用和上游调控机制在很大程度上仍不明确。自噬作为一种基本的细胞回收过程，在此语境中发挥双重作用：一方面，自噬通过降解受损细胞器和蛋白质维持细胞稳态；另一方面，它通过降解铁蛋白释放游离铁并促进脂质过氧化来促进铁死亡。自噬与铁死亡之间的这种动态且依赖背景的相互作用日益被认为是应激条件下细胞命运的关键调节因子。

泛素化和去泛素化是调控蛋白质稳态和细胞命运的关键翻译后修饰。作为主要的去泛素化酶，泛素特异性蛋白酶5（Ubiquitin-Specific Protease 5, USP5）参与多种生理过程，包括DNA修复和细胞死亡调控。然而，USP5在神经元存活和SCI中的功能尚未完全阐明。基于此，研究人员提出假设：USP5通过诱导神经元自噬依赖性铁死亡促进SCI进展，靶向USP5可能代表减轻脊髓缺血再灌注后神经元损伤的有前景的治疗策略。

## 二、关键技术方法

本研究采用的技术方法主要包括：体内构建方面，使用动脉瘤夹夹闭C57BL/6J小鼠腹主动脉建立SCI模型，并使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建USP5敲除（USP5^-/-）小鼠；体外培养方面，采用原代神经元并进行氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理模拟缺血再灌注损伤；功能检测方面，运用CCK-8法检测细胞活力，蛋白免疫印迹（WB）和免疫荧光（IF）检测蛋白表达，透射电子显微镜（TEM）观察自噬超微结构，DCFH-DA探针和C11-BODIPY 581/591检测ROS和脂质过氧化，GSH、4-HNE、MDA和Fe²⁺试剂盒检测相关生化指标，PI染色评估细胞死亡，肌电图（EMG）评估神经肌肉功能；分子互作验证方面，采用免疫共沉淀（Co-IP）和免疫沉淀-质谱联用（IP/MS）鉴定USP5相互作用蛋白，环己酰亚胺（CHX）追踪实验和MG132处理分析蛋白稳定性，泛素化实验分析去泛素化特异性；此外，还利用了GSE162610单细胞转录组数据集进行生物信息学分析。

## 三、研究结果

### 3.1 USP5调控SCI后神经元铁死亡

研究人员首先确定了神经元在脊髓缺血再灌注期间是否发生铁死亡。原代神经元经OGD/R或铁死亡诱导剂Erastin处理后，细胞活力显著降低，伴随GSH降低及MDA、4-HNE、Fe²⁺和ROS水平升高，ACSL4上调而GPX4和FTH1下调，这些改变被铁死亡抑制剂Liproxstatin-1逆转。体内实验中，SCI小鼠脊髓组织呈现ACSL4上调、GPX4和FTH1下调，以及GSH降低、MDA、Fe²⁺和ROS升高，Liproxstatin-1给药缓解了这些铁死亡相关改变。此外，WB和IF分析显示USP5在SCI脊髓和OGD/R处理神经元中显著上调，单细胞转录组分析结合免疫荧光共定位揭示USP5在神经元和星形胶质细胞中均有表达，但在神经元中显著富集。这些发现表明USP5至少部分通过促进神经元铁死亡参与SCI进展。

### 3.2 高表达USP5作为神经元铁死亡的关键介导因子

为探究USP5在神经元铁死亡中的作用，研究人员构建了USP5过表达和沉默神经元。WB分析显示，USP5过表达显著增加ACSL4水平，降低FTH1和GPX4表达，伴随GSH降低及Fe²⁺、MDA、4-HNE浓度升高；反之，USP5敲除逆转了这些铁死亡相关改变。此外，USP5过表达显著增加ROS水平、降低细胞活力并促进神经元死亡，而USP5敲除发挥保护作用。

在体实验中，USP5^-/-小鼠SCI后脊髓组织铁死亡显著减轻，表现为ACSL4下调和GPX4、FTH1上调，DHE染色显示ROS水平明显降低。肌电图分析显示USP5^-/-小鼠神经功能改善，运动诱发电位（Motor-Evoked Potential, MEP）幅度更高、潜伏期更短。H&E和Nissl染色进一步证实USP5缺失减轻了SCI后神经元丢失、空泡化、坏死和血管损伤。此外，SCI小鼠中USP5过表达加剧了铁死亡和神经元损伤。这些发现表明高表达USP5促进神经元铁死亡并损害SCI后神经功能恢复。

### 3.3 USP5调控神经元自噬依赖性铁死亡

鉴于自噬与铁死亡的密切相互作用，研究人员进一步探究USP5是否调控神经元自噬。WB分析显示，USP5过表达显著增加LC3-II转化，上调ATG7、ATG5和Beclin-1表达，而USP5敲除产生相反效果；自噬底物p62在USP5过表达时显著升高而在沉默后降低。mRFP-GFP-LC3示踪实验证实USP5显著增强神经元自噬通量，而USP5耗竭损害自噬通量。TEM显示USP5缺失减少自噬体和自噬溶酶体数量，而USP5过表达促进其积累。

为评估USP5诱导的铁死亡是否依赖自噬，研究人员采用氯喹（CQ）或Ad-shATG5抑制自噬。药理学和遗传学抑制自噬均逆转了USP5过表达诱导的铁死亡相关蛋白改变，显著缓解了OGD/R诱导的GSH降低及MDA、Fe²⁺升高，并显著挽救了OGD/R诱导的神经元活力降低和细胞死亡增加。这些发现证明USP5促进自噬激活，这是神经元铁死亡执行的功能性前提。

### 3.4 USP5介导的去泛素化调控c-MAF

为探究USP5调控自噬依赖性铁死亡的机制，研究人员进行IP/MS分析鉴定其相互作用伙伴。内源性和外源性Co-IP均证实了USP5与c-MAF之间的稳健相互作用，且该相互作用在OGD/R刺激下进一步增强。OGD/R或Erastin处理增加c-MAF蛋白水平，而USP5敲除显著逆转这一效应，提示USP5调控c-MAF稳定性。

作为去泛素化酶，USP5可能通过泛素依赖性蛋白酶体降解控制c-MAF表达。CHX追踪实验显示USP5耗竭显著缩短c-MAF半衰期；蛋白酶体抑制剂MG132预处理恢复了USP5缺失神经元中的c-MAF水平。催化失活USP5突变体（C335A）显著降低c-MAF稳定性。泛素化实验显示USP5敲除增加c-MAF泛素化和降解，而USP5酶活性失活产生类似效应。USP5缺失小鼠脊髓组织呈现c-MAF泛素化升高和蛋白水平降低，而USP5过表达稳定c-MAF。

研究人员进一步检测USP5对多聚泛素连接的特异性。USP5选择性去除c-MAF上的K48连接泛素链，而不影响K63连接泛素化；K48位点突变（K48R）消除了USP5介导的c-MAF去泛素化。这些数据表明USP5通过去除K48连接多聚泛素链并阻止其蛋白酶体降解来稳定c-MAF。

### 3.5 抑制c-MAF逆转USP5介导的神经元铁死亡

为阐明c-MAF在USP5介导铁死亡中的作用，研究人员观察到c-MAF敲除显著降低神经元自噬激活，而过表达则增强之。在共转染USP5和c-MAF siRNA的神经元中，c-MAF沉默有效逆转了USP5诱导的ROS增加，抑制了ACSL4上调和GPX4/FTH1下调等铁死亡相关标志物。反之，USP5和c-MAF共过表达进一步加重铁死亡损伤。细胞活力实验显示c-MAF敲除显著恢复USP5诱导的神经元死亡，而共过表达则显著加剧神经元丢失。

体内实验验证了这些发现。接受AAV介导USP5过表达联合c-MAF敲除的SCI小鼠显著逆转了USP5过表达诱导的ACSL4上调和FTH1/GPX4抑制，DHE染色显示c-MAF抑制组脊髓组织ROS水平降低。肌电图分析进一步显示c-MAF抑制改善了功能，MEP幅度增加、潜伏期缩短。组织学评估证实USP5过表达导致SCI脊髓中神经元丢失、空泡化和结构紊乱，而c-MAF抑制显著缓解了这些改变。这些发现证明USP5通过c-MAF稳定化及随后激活自噬依赖性铁死亡促进神经元铁死亡和SCI进展。

## 四、讨论总结与研究结论

研究人员在讨论部分首先指出，尽管众多研究阐明了铁死亡与多种疾病的关系，但SCI与铁死亡之间的联系尚未完全澄清，调节该过程的特异性分子机制仍属未知。本研究首次证明铁死亡在SCI期间发生于神经元，USP5作为该事件的关键介导因子出现。研究的关键概念性进步在于将USP5鉴定为铁死亡易感性的上游放大器，而非细胞死亡的被动下游效应子。研究还揭示了自噬在传统保护机制之外，在特定病理条件下可作为促死亡机制，USP5驱动的自噬在SCI的铁超载和ROS积累背景下可能降低铁死亡执行的阈值。此外，单细胞转录组和免疫荧光分析显示USP5不仅限于神经元，也在星形胶质细胞中表达，提示可能存在协调神经元-胶质相互作用的机制，未来需用细胞类型特异性USP5消融来阐明。

研究人员进一步将c-MAF鉴定为USP5的直接底物，为其机制特异性增添证据。此前研究主要集中于c-MAF在免疫和发育调控中的作用，而本研究揭示USP5通过去除K48连接多聚泛素链稳定c-MAF，提示转录重编程可能解释USP5诱导的铁死亡易感性增加。从更广泛的视角，研究结果提示SCI中的神经元铁死亡并非单纯代谢失衡的后果，而是主动受翻译后调控网络调控，USP5–c-MAF轴可作为分子开关将缺血诱导的应激转化为不可逆的神经元丢失。从转化角度，USP5–c-MAF轴代表减轻SCI铁死亡驱动神经元损伤的有前景的治疗靶点，开发具有足够血-脊髓屏障通透性的USP5选择性抑制剂应在未来研究中优先推进。

研究结论部分指出：总之，研究结果表明SCI过程中神经元发生铁死亡。本研究创新性提出USP5通过去泛素化调控c-MAF表达，从而激活神经元自噬并促进神经元铁死亡。这有助于深入理解SCI中铁死亡的机制。此外，研究人员证实SCI后敲除USP5发挥神经保护作用。靶向USP5可能因此成为SCI神经元损伤的潜在治疗方法。