VEGFR2缺失通过胶质-神经元相互作用增加光感受器变性的易感性

《Cell Death & Disease》：VEGFR2 deletion increases susceptibility to photoreceptor degeneration through glial-neuronal interaction

　　

眼内抗VEGFA（血管内皮生长因子A）注射常用于对抗新生血管形成，例如新生血管性年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）。然而，在临床情境中，同一只眼睛同时患有萎缩性（干性）和新生血管性（湿性）AMD的患者会接受抗VEGFA注射，但有报道称这会严重促进干性AMD中萎缩区域的发展。为了研究这一现象，研究人员使用了他莫昔芬依赖性敲除眼中Vegfr2（血管内皮生长因子受体2）的小鼠（Vegfr2Δeye）以及光损伤模型来模拟干性AMD的某些特征。研究人员检查了视网膜形态和功能、光感受器变性程度以及视网膜蛋白质组的变化。虽然由于VEGF信号缺陷，稳态视网膜形态和功能未发生改变，但光诱导的光感受器变性在Vegfr2Δeye视网膜中显著加剧，同时伴随AKT（蛋白激酶B）激酶通路激活减弱。此外，利用单核RNA测序数据，研究人员发现在人类健康、干性和湿性AMD视网膜中，Vegfr2主要在大胶质细胞中表达。这表明从大胶质细胞到光感受器存在VEGF依赖的神经保护性串扰，并提出了有前景的治疗方案来减轻人类光感受器变性。然而，研究人员的数据也表明，在存在神经退行性合并症时，应谨慎考虑抗VEGF治疗。

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）是西方国家老年人失明的主要原因，其晚期可表现为新生血管性（湿性）AMD和地理萎缩性（干性）AMD，且两种形式可在同一只眼中共存。临床上常用抗VEGFA（血管内皮生长因子A）注射治疗新生血管，但有证据表明该治疗可能促进干性AMD中萎缩区域的进展，但其机制尚不明确。为探索VEGF信号缺失是否影响光感受器生存，研究人员利用他莫昔芬（tamoxifen）依赖的Cre/loxP系统在成年小鼠眼中条件性敲除Vegfr2（血管内皮生长因子受体2），获得Vegfr2Δeye小鼠，并采用光损伤模型（5000 lux冷白光暴露30分钟）模拟干性AMD的部分特征。通过形态学、功能学、蛋白质组学及单核RNA测序（single nuclei RNA sequencing, snSeq）等分析，研究人员发现：在健康视网膜中，VEGFR2缺失几乎不影响形态、功能和蛋白质组；但在光损伤应激下，VEGR2缺失显著加剧光感受器变性，表现为外核层（outer nuclear layer, ONL）厚度减少和凋亡细胞增多，该效应与AKT（蛋白激酶B）磷酸化水平降低相关，而非通过改变Lif（白血病抑制因子）、Fgf2（成纤维细胞生长因子2）等神经保护因子表达。人类视网膜snSeq数据显示VEGFR2主要表达于大胶质细胞（星形胶质细胞和Müller细胞），提示VEGF信号依赖的胶质-神经元串扰发挥神经保护作用。该研究为理解抗VEGF治疗可能促进干性AMD萎缩提供了实验证据，提示临床需谨慎评估利弊，尤其对于干湿共存患者。论文发表在《Cell Death》。

研究人员采用的关键技术方法包括：他莫昔芬滴眼液诱导的Vegfr2条件性敲除小鼠模型；光损伤模型（小鼠暗适应后暴露于5000 lux冷白光30分钟）；视网膜形态学分析（半薄切片Richardson染色及ONL厚度测量）；视网膜电图（electroretinography, ERG）评估功能；液相色谱-串联质谱（LC-MSMS）蛋白质组学；Western blot检测AKT及磷酸化AKT（pAKT）表达；单核RNA测序分析人类视网膜样本（数据来源于ENA PRJNA912653，包括3例健康、3例湿性AMD和3例干性AMD供体）。此外还使用免疫组织化学、qPCR等方法。

**条件性敲除成年小鼠眼中Vegfr2：视网膜形态和功能**。通过他莫昔芬处理实现Vegfr2 mRNA和蛋白显著下调，但半薄切片和ERG分析显示，Vegfr2Δeye小鼠视网膜内外核层厚度、暗适应和光适应波形与野生型无差异，血管结构和灌注正常，表明在不施加应激时，VEGFR2缺失不影响健康视网膜。

**Vegfr2缺失与视网膜蛋白质组**。蛋白质组学鉴定3729种蛋白，经多重假设校正后无蛋白显著差异；放松标准后仅发现Ras相关蛋白Rab-23（RAB23）上调约40%，醛脱氢酶3家族成员A1（ALDH3A1）下调约48%，提示VEGFR2缺失对蛋白质组影响极小。

**Vegfr2缺失导致光暴露视网膜中显著的形态改变**。光损伤后，Vegfr2Δeye视网膜中TUNEL阳性细胞显著增多，ONL厚度明显变薄（仅约3层细胞核，野生型为5-6层），且ERG振幅略有降低，表明结构破坏伴随功能下降。

**Vegfr2缺失不改变神经保护因子的表达**。qPCR检测显示，光损伤后Lif、Fgf2、Et2（内皮素2）和Gfap（胶质纤维酸性蛋白）在两组中均显著上调，但组间无差异，说明加剧的变性不依赖于这些因子的差异表达。

**光损伤下Vegfr2缺失与视网膜蛋白质组**。光损伤6小时后，野生型视网膜中emerin（EMD）下调，而在Vegfr2Δeye中未见下调，反而有上调趋势；交互分析仅EMD显著差异，提示emerin参与VEGF信号缺失下的病理过程。

**Vegfr2缺失抑制光损伤下AKT的激活**。Western blot显示，野生型视网膜光损伤后pAKT/AKT比值显著升高，而Vegfr2Δeye中无此变化，说明VEGFR2缺失阻碍了AKT通路的激活，从而削弱神经保护。

**Vegfr2在人类视网膜各细胞群中的表达**。snSeq分析表明，Vegfr2（KDR）在健康和AMD视网膜中主要表达于星形胶质细胞和Müller细胞，光感受器中几乎不表达，提示大胶质细胞是VEGF信号介导神经保护的关键细胞。

讨论中，研究人员指出，在健康成年视网膜中VEGFR2缺失影响甚微，但在应激条件下，该缺失通过减少emerin下调和抑制AKT磷酸化加剧光感受器凋亡。单核测序结果支持Müller细胞/星形胶质细胞通过VEGF信号向光感受器传递神经保护信号。这些发现与临床观察一致，即抗VEGF治疗可能促进干性AMD萎缩进展。研究结论部分翻译如下：基于研究结果，研究人员认为，视网膜VEGF信号缺失仅轻微影响视网膜蛋白质组，在发育后的健康视网膜中不引起明显的形态和功能异常；但在病理条件下，如光诱导的光感受器变性（模拟干性AMD），VEGF信号缺失显著促进光感受器变性。分子水平上，这并不涉及Lif、Et2或Fgf2等神经保护因子的表达改变，而是涉及emerin表达增加和AKT磷酸化缺失。最后，人类视网膜样本的单核测序数据提示存在VEGF依赖的胶质细胞向光感受器的神经保护性串扰。