《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Immune Infiltration-Related Genes as Potential Biomarkers and Predicted Targets for Renal Allograft Delayed Graft Function and Survival Outcome: An Integrated Machine Learning Approach and Drugs Analysis
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背景：缺血再灌注损伤（IRI）显著影响肾移植（KTx）后的结局，导致延迟移植物功能（DGF）和潜在的移植物丢失。目前针对DGF和移植物存活的生物标志物和疗法尚不充分。肾IRI后的免疫细胞浸润在驱动炎症和损伤中至关重要。方法：为解决这一问题，本研究利用来自基因表
背景：缺血再灌注损伤（IRI）显著影响肾移植（KTx）后的结局，导致延迟移植物功能（DGF）和潜在的移植物丢失。目前针对DGF和移植物存活的生物标志物和疗法尚不充分。肾IRI后的免疫细胞浸润在驱动炎症和损伤中至关重要。方法：为解决这一问题，本研究利用来自基因表达综合数据库（GEO）的微阵列和RNA-seq数据集，识别IRI患者中差异表达的免疫浸润相关基因（DE-IRGs）。机器学习（ML）算法确定了核心DE-IRGs，有助于预测模型构建以及将KTx后IRI样本分为不同簇和风险组。利用NetworkAnalyst 3.0构建了包含转录因子（TFs）和微小RNA（miRNAs）的调控网络，并通过Enrichr和分子对接模拟探索了预测的化合物/常用免疫抑制剂。结果：分析揭示了47个DE-IRGs，其中核心基因（肾上腺髓质素[ADM]、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族H成员1[SERPINH1]、溶质载体家族2成员3[SLC2A3]、BCL-2相关永生基因3[BAG3]、NFKB抑制因子α[NFKBIA]、Kruppel样因子6[KLF6]和CCAAT/增强子结合蛋白δ[CEBPD]）与DGF相关，部分与移植物存活相关。预测模型基于内部验证表现出稳健性能，DGF模型的受试者工作特征曲线下面积（AUC）分别为0.832和0.975，移植物存活模型在1年、2年和3年的AUC分别为0.773、0.742和0.757。在簇A或高风险组中，较高的免疫细胞浸润与不良结局相关。与DGF相关的关键免疫细胞包括活化CD8 T细胞、活化树突状细胞（DCs）和效应记忆CD4 T细胞。研究确定了核心调控TFs和miRNAs，以及四种核心预测化合物：对乙酰氨基酚、雌二醇、丙戊酸和小檗胺（需要进一步的药理学验证），和三种常用免疫抑制剂：环孢素A、吗替麦考酚酯（MMF）和他克莫司。结论：本研究识别了KTx后IRI过程中与免疫细胞最相关的潜在核心基因，揭示了基因、免疫细胞和KTx结局之间复杂的相互作用。
肾移植（KTx）是终末期肾病（ESKD）的最佳治疗策略，但缺血再灌注损伤（IRI）常导致延迟移植物功能（DGF）和移植物丢失。现有基于供者人口学的临床预测工具敏感性和特异性不足，缺乏可靠的分子生物标志物。IRI引发免疫细胞大量浸润，驱动炎症和损伤，但人类KTx患者中免疫浸润的转录组特征尚不清楚。为此，研究人员整合了来自基因表达综合数据库（GEO）的微阵列和RNA-seq数据集（GSE43974、GSE90861、GSE21374），采用机器学习（ML）方法（随机森林[RF]、支持向量机递归特征消除[SVM-RFE]、最小绝对收缩和选择算子[LASSO]）筛选免疫浸润相关基因（IRGs），构建DGF和移植物存活预测模型，并进行亚型分类、调控网络分析和药物预测。研究发现47个差异表达IRGs（DE-IRGs），其中7个核心DE-IRGs（ADM、SERPINH1、SLC2A3、BAG3、NFKBIA、KLF6、CEBPD）与DGF相关，6个与移植物存活相关。预测模型AUC达0.83–0.98，优于现有临床工具。患者被分为两种免疫亚型（簇A和B），高风险组免疫浸润更严重，DGF和移植物丢失发生率更高。核心免疫细胞包括活化CD8 T细胞、活化树突状细胞（DCs）和效应记忆CD4 T细胞。研究构建了转录因子（TFs）和微小RNA（miRNAs）调控网络，并预测了对乙酰氨基酚、雌二醇、丙戊酸和小檗胺等潜在化合物。该研究为KTx后DGF和移植物预后的早期诊断及靶向治疗提供了新见解，论文发表在《MEDIATORS OF INFLAMMATION》。
关键技术方法概述：本研究主要利用三种机器学习算法（RF、SVM-RFE、LASSO）筛选核心基因，基于GEO数据库中三个数据集（GSE43974：188例术前+203例术后肾活检；GSE90861：23例配对活检，含11例即刻功能[IGF]和12例DGF；GSE21374：282例晚期KTx后活检，206例有3年生存信息）进行差异表达分析、免疫浸润评估（ssGSEA、quanTIseq、xCELL、MCP-counter）、共识聚类、Cox回归构建生存模型，并利用NetworkAnalyst 3.0构建TF和miRNA调控网络，最后通过Enrichr和AutoDock Vina进行药物预测和分子对接模拟。
研究结果：
3.1 **DE-IRGs的鉴定和外部验证**：通过比较GSE43974中IRI前后肾活检，鉴定出132个上调差异表达基因（DEGs），与2903个IRGs取交集得到47个上调和DE-IRGs。在独立数据集GSE90861中验证了其上调表达。
3.2 **DE-IRGs的蛋白质相互作用、生物学功能和免疫相关性**：蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络显示高互作性，基因本体（GO）分析富集于细菌来源分子反应、白细胞介素-1应答、趋化因子活性等，京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析富集于TNF、IL-17、NOD样受体、Toll样受体等通路。免疫细胞浸润分析显示IRI后16种免疫细胞显著增多，MAP3K8与肥大细胞最强正相关，CEBPD与未成熟DC最强负相关。
3.3 **DGF相关核心DE-IRGs的鉴定和DGF预测模型构建**：通过RF和SVM-RFE算法筛选10个特征基因，LASSO回归最终确定7个核心DE-IRGs（CEBPD、KLF6、NFKBIA、BAG3、SLC2A3、SERPINH1、ADM）及系数构建DGF风险评分模型。训练集、测试集和全体集的AUC分别为0.792、0.924和0.832，校准曲线和Hosmer-Lemeshow检验良好。基于风险评分将患者分为高风险组（DGF占比70.3%）和低风险组（19.8%）。加入供者类型（活体、DBD、DCD）的临床模型AUC达0.975。
3.4 **IRI患者中核心DE-IRGs相关亚型的分层**：基于7个核心DE-IRGs表达谱的共识聚类将203例IRI患者分为簇A（n=87）和簇B（n=116）。簇A中BAG3、SLC2A3、SERPINH1上调，KLF6、NFKBIA、CEBPD下调，ADM无差异。簇A供者多来自DCD（69.0%），DGF发生率显著更高（69.0% vs 27.0%）。
3.5 **核心差异浸润免疫细胞（DI-ICs）与DGF相关核心DE-IRGs的相关性**：LASSO回归从16种DI-ICs中确定三种核心DI-ICs：活化CD8 T细胞、活化DC和效应记忆CD4 T细胞。相关性分析显示所有7个核心DE-IRGs与活化DC显著正相关，SLC2A3和SERPINH1与活化CD8 T细胞显著正相关，CEBPD与效应记忆CD4 T细胞显著正相关。
3.6 **不同DGF风险组的髓系免疫浸润和临床特征**：高风险组中未成熟DC和巨噬细胞（ssGSEA）及中性粒细胞（xCELL、MCP-counter）丰度更高，且更多来自DCD供者和簇A。
3.7 **DGF相关TFs-核心DE-IRGs和TFs-miRNAs调控网络构建**：NetworkAnalyst 3.0分析识别196个TFs与7个核心DE-IRGs互作，KLF6连接最多（104个）。核心TFs包括RARA、TFDP1、SIN3A、SMC3、CHD1。TF-miRNA-hub DE-IRG网络包含107个miRNAs和151个TFs，核心miRNAs为hsa-miR-181a/b/c/d，核心TFs为MEF2A和YY1。
3.8 **DGF相关核心DE-IRGs的化合物预测和分子对接模拟**：Enrichr/DSigDB预测516个化合物，筛选出15个具有免疫抑制潜力的候选物，包括对乙酰氨基酚、雌二醇、丙戊酸、小檗胺等。分子对接显示雌二醇和小檗胺与ADM、SERPINH1、SLC2A3结合力强（结合能<-7 kcal/mol），对乙酰氨基酚和丙戊酸为中等结合。
3.9 **常用免疫抑制剂与关键DGF相关核心DE-IRGs的分子对接分析**：环孢素A与ADM、SERPINH1、SLC2A3的结合能最强（-10.5至-14.6 kcal/mol），其次为他克莫司（-8.9至-10.4 kcal/mol），吗替麦考酚酯（MMF）最弱（-5.4至-7.4 kcal/mol）。
3.10 **长期移植物存活预测相关DE-IRGs的发现**：基于GSE21374数据集，单变量Cox回归筛选出8个预后相关DE-IRGs，LASSO确定6个存活相关核心DE-IRGs（BAG3、ADM、SLC2A3、SERPINH1、CEBPD、KLF6）构建风险评分模型。时间依赖ROC显示1、2、3年AUC在全体集分别为0.773、0.742、0.757。高风险组移植物丢失和排斥发生率显著更高。
3.11 **核心DE-IRGs对肾移植物功能临床意义的验证**：Nephroseq v5数据库分析显示ADM、SERPINH1、SLC2A3、NFKBIA、KLF6的表达与估算肾小球滤过率（eGFR）显著负相关，而BAG3和CEBPD呈正相关。
3.12 **小鼠单侧肾IRI（UIRI）模型中的体内验证**：H&E染色显示UIRI组肾小管严重损伤和炎症细胞浸润。qRT-PCR证实Bag3、Serpinh1、Klf6、Slc2a3表达显著上调，而Nfkbia和Adm无明显变化，可能与物种差异或瞬时表达有关。
讨论部分总结：本研究通过整合多平台转录组数据和机器学习方法，首次系统揭示了肾移植后IRI早期免疫浸润的转录组特征及其对DGF和长期移植物存活的影响。鉴定出7个核心DE-IRGs（ADM、SERPINH1、SLC2A3、BAG3、NFKBIA、KLF6、CEBPD），它们与免疫细胞浸润密切相关，此前研究已证实它们参与免疫调节和炎症过程。基于这些基因的共识聚类识别出两种IRI亚型，簇A呈现更严重的免疫浸润和更高的DGF风险。三种核心免疫细胞（活化CD8 T细胞、活化DC、效应记忆CD4 T细胞）被确定为DGF的关键驱动因子。构建的DGF和移植物存活预测模型表现出优越性能，优于现有工具。调控网络识别出关键TFs（RARA、TFDP1等）和miRNAs（miR-181家族），为理解转录后调控提供线索。药物预测和分子对接提示对乙酰氨基酚、雌二醇、丙戊酸和小檗胺可能通过调节免疫响应改善DGF，而常用免疫抑制剂（环孢素A、MMF、他克莫司）与核心基因的强结合为它们抗排斥机制提供新解释。小鼠模型验证了Bag3、Serpinh1、Klf6、Slc2a3在IRI后上调。研究局限性包括多平台数据异质性、缺乏深度机制验证和体内药理学验证。
研究结论翻译：在本研究中，研究人员深入探讨了肾IRI与移植物排斥之间的复杂相互作用，两者均对KTx患者的移植物存活构成重大威胁。通过审视转录组特征，研究人员首次为早期IRI后阶段的免疫浸润过程及其对DGF发生和长期移植物存活率的影响提供了新颖且全面的见解。通过分析47个DE-IRGs的表达谱，研究人员确定了与DGF相关的核心DE-IRGs（ADM、SERPINH1、SLC2A3、BAG3、NFKBIA、KLF6和CEBPD）和与移植物存活相关的核心DE-IRGs（BAG3、ADM、SLC2A3、SERPINH1、CEBPD和KLF6），从而突出了这些过程中的潜在分子参与者。利用这些核心基因，研究人员将肾移植后IRI患者分为不同组别，阐明了它们在免疫细胞浸润丰度和临床特征上的差异。此外，研究人员构建了DGF相关核心DE-IRGs的转录调控网络，鉴定了关键调控TFs（RARA、TFDP1、SIN3A、SMC3、CHD1、MEF2A和YY1）和miRNAs（hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-181c和hsa-miR-181d）。还确定了潜在的预测化合物（对乙酰氨基酚、雌二醇、丙戊酸和小檗胺），并探索了常用免疫抑制剂（环孢素A、MMF和他克莫司）。这些预测化合物需要进一步的药理学验证。最后，研究人员基于核心DE-IRGs开发了DGF（AUC=0.832和AUC=0.975）和移植物存活（1、2、3年AUC分别为0.773、0.742和0.757）的预测模型，可能提高对移植患者预后的预测能力。
