《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Experimental Study of YaJieShaBa Antialcoholic Hepatic Fibrosis Through TGF-β1/Smad Signaling Pathway
目的：本研究旨在明确雅解沙巴（YaJieShaBa, YJSB）抗酒精性肝纤维化（Hepatic Fibrosis, HF）的药效学作用，并阐明其调控转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）/Smad通路的作用机制。方法：采用56%乙醇（10 mL/kg）诱导大鼠酒精性HF模型。通过综合评估体重、肝质量及肝指数、生化肝功能指标[天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST）和丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）]、肝纤维化生物标志物[Ⅲ型前胶原氨基端肽（Type Ⅲ Procollagen Amino-terminal Propeptide, PⅢNP）、Ⅳ型胶原（Type-Ⅳ Collagen, COL-Ⅳ）、层粘连蛋白（Laminin, LN）和透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）]、血清羟脯氨酸（Hydroxyproline, Hyp）及TGF-β1水平、肝细胞匀浆中Ⅰ型胶原（COL-I）、Ⅲ型胶原（COL-Ⅲ）及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth Muscle Actin, α-SMA）水平，以及苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色、银（Ag）染色和Masson三色染色观察肝组织病理改变，评价YJSB抗肝纤维化的药理功效。采用通路聚焦型qPCR阵列检测对照组、模型组及YJSB组肝组织中TGF-β1、Keap1-Nrf2和TLR4/MyD88等信号通路相关的72个基因表达，筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）及关键信号通路。随后基于qPCR阵列结果，采用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、蛋白质免疫印迹（Western Blotting, WB）和免疫荧光方法验证YJSB的作用机制。体外实验中应用TGF-β1受体抑制剂判断当TGF-β1/Smad通路被最大阻断时YJSB是否仍有额外保护作用，并通过添加外源性TGF-β1进行挽救实验观察能否逆转YJSB的抑制作用。结果：YJSB给药显著升高酒精性HF大鼠体重并降低肝指数；显著降低血清AST、ALT、PⅢNP、COL-Ⅳ、LN、HA、Hyp及TGF-β1水平，降低肝匀浆COL-I、COL-Ⅲ及α-SMA水平；H&E、Ag及Masson染色显示肝损伤显著减轻。qPCR阵列结果显示模型组相比空白组有65个基因上调、7个基因下调（40个具统计学意义），YJSB组相比模型组有68个基因下调、4个基因上调（34个具统计学意义），DEGs主要富集于TGF-β1信号通路。此外YJSB降低肝组织匀浆炎性因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）、IL-6、IL-8水平，升高超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GSH-Px）和过氧化氢酶（Catalase, CAT）水平，降低丙二醛（Malondialdehyde, MDA）和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平。WB结果显示YJSB下调肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2（Phosphorylated Smad2, P-Smad2）及磷酸化Smad3（Phosphorylated Smad3, P-Smad3）表达；免疫荧光表明YJSB下调肝细胞核内Smad4表达。体外实验证明YJSB主要通过抑制TGF-β受体1（TGF-β Receptor Type 1, TGF-βR1）活化、有效下调P-Smad2/3蛋白水平发挥作用（经TGF-βR1抑制剂LY2157299验证）；挽救实验中外源性TGF-β1部分逆转YJSB对P-Smad2/3的抑制，表明YJSB抗纤维化作用与TGF-β1/Smad通路高度相关。结论：YJSB通过调控TGF-β1/Smad信号通路（TGF-β1/Smad Signaling Pathway, TSSP）抑制炎症及氧化应激相关级联反应，从而抑制酒精性HF进展，证实YJSB在动物模型中具有抗酒精性HF潜力，为其后续研究与临床应用提供实验依据。
论文解读：雅解沙巴(YJSB)通过TGF-β1/Smad信号通路干预酒精性肝纤维化的实验研究
肝纤维化(Hepatic Fibrosis, HF)是各类慢性肝损伤向肝硬化发展的共同病理过程，全球患病率约1%–2%，每年致百万人死亡。酒精性肝病是重要病因之一，目前临床常用药物如秋水仙碱(Colchicine, COL)和促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic Hormone, ACTH)因骨髓抑制、水钠潴留等副作用限制其应用。傣族医药中的复方雅解沙巴(YaJieShaBa, YJSB)由八味植物药组成，临床用于酒精性肝损伤及肝炎，前期研究表明其对四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)及胆管结扎诱导的肝纤维化有效且可降低TGF-β1水平，但其对酒精性肝纤维化的作用及是否经TGF-β1/Smad信号通路(TGF-β1/Smad Signaling Pathway, TSSP)起效尚待阐明。本研究以SD大鼠酒精性肝纤维化模型及TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells, HSCs)HSC-T6活化模型，从整体动物、组织、基因及蛋白水平探讨YJSB的抗肝纤维化药效与分子机制，论文发表于《Mediators of Inflammation》。
主要关键技术方法：
研究人员建立56%乙醇(10 mL/kg)灌胃诱导的雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠酒精性HF模型，设对照组、模型组、阳性药COL组、复方鳖甲软肝片(Compound Turtle Shell Soft Liver Tablets, CBRTs)组及YJSB低、中、高剂量组(n=10)；检测一般状态、肝指数、血清ALT/AST及纤维化标志物(HA、PⅢNP、COL-Ⅳ、LN)、Hyp、TGF-β1，肝组织α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ，行H&E、Masson及Ag染色评估病理；采用通路聚焦型qPCR阵列检测肝组织72个HF相关基因筛选差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)；以ELISA测炎性因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8)及氧化应激指标(SOD、GSH-Px、CAT、MDA、ROS)；Western Blotting检测TGF-β1、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3蛋白表达；免疫荧光检测肝细胞核Smad4；体外以TGF-β1(10 ng/mL)诱导HSC-T6细胞活化，设TGF-βR1抑制剂LY2157299对照及外源性TGF-β1挽救实验，Western Blotting检测P-Smad2/3验证YJSB对TSSP的干预。
研究结果
4.2. YJSB Improves the General State of Alcoholic HF Rats
模型组大鼠活动减少、毛色晦暗、精神萎靡，YJSB各剂量组精神状态、毛色、饮食及粪便较模型组改善。
4.3. YJSB Improves Liver Morphology in Alcoholic HF Rats
模型组肝脏表面不平整、质硬、见白色结节及腹水，YJSB组腹水减少、表面较平整、色泽回红、白色结节明显减少。
4.4. YJSB Increased Body Weight and Liver Mass in Alcoholic HF Rats While Decreasing the Liver Index
模型组第7–42天体重显著低于对照组(p<0.05或p<0.01)，终末肝质量降低、肝指数升高(p<0.05或p<0.01)；YJSB各剂量组体重较模型组显著升高(p<0.05或p<0.01)，肝质量升高(p<0.05或p<0.01)，肝指数显著降低(p<0.01)。
4.5. Effect of YJSB on the Biochemical Indices of Liver Function
模型组血清ALT、AST显著升高(p<0.01)，YJSB各剂量组较模型组显著降低(p<0.01)，提示YJSB改善酒精所致肝细胞损伤。
4.6. YJSB Reduced the Levels of the Four Biomarkers of Alcoholic HF (HA, PⅢNP, COL-Ⅳ, and LN)
模型组血清HA、PⅢNP、COL-Ⅳ、LN显著升高(p<0.01)，YJSB中、高剂量组四项均显著降低(p<0.01)，低剂量组除PⅢNP外均显著降低(p<0.01)，表明YJSB抑制细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)相关血清标志物升高。
4.7. YJSB Diminished the Serum Levels of Hyp and TGF-β1 in Rats With Alcoholic HF
模型组血清Hyp及TGF-β1显著升高(p<0.01)，YJSB各剂量组均显著降低(p<0.01)，说明YJSB下调胶原沉积标志Hyp及关键致纤维化因子TGF-β1。
4.8. YJSB Downregulated the Contents of α-SMA, COL-I, and COL-Ⅲ in Liver Tissue Homogenates
模型组肝匀浆α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ显著升高(p<0.01)，YJSB各剂量组均显著降低(p<0.01)，提示YJSB抑制HSC活化标志α-SMA及胶原分泌。
4.9. YJSB Alleviated the Infiltration of the Liver by Inflammatory Cells in Alcoholic HF Rats
H&E染色示模型组肝细胞坏死、水样变性、脂变及炎细胞浸润明显，YJSB组炎症浸润减轻、水肿与坏死减少、肝小叶结构改善。
4.10. YJSB Repressed the Deposition of Collagen Fibers in the Liver of Alcoholic HF Rats
Masson染色示模型组蓝色胶原纤维沉积显著增加(p<0.01)，YJSB中、高剂量组胶原沉积显著低于模型组(p<0.01)。
4.11. YJSB Attenuated the Deposition of Reticular Fibers in the Livers of Alcoholic HF Rats
Ag染色示模型组网状纤维沉积显著增加(p<0.01)，YJSB中、高剂量组网状纤维沉积显著低于模型组(p<0.01)。
4.12. DEG Results
qPCR阵列分析显示模型组vs对照组65个基因上调(含TGF-β1、MCP-1、IL-6)、7个下调(含CAT、CYP2E1)，31个差异显著(|FC|≥2, p<0.05)；YJSB组vs模型组68个基因下调(含TGF-β1、CTGF、MMP-2、NF-κB)、4个上调(含CAT、CYP2E1)，34个差异显著(|FC|≥2, p<0.05)，DEGs主要富集于TGF-β1信号通路，关键基因TGF-β1模型组上调4.08倍(p=0.0039)、YJSB组下调3.49倍(p=0.0016)。
4.13. YJSB Attenuated the Release of Inflammation-Related Factors
模型组肝匀浆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8显著高于对照组(p<0.01)，YJSB各剂量组较模型组显著降低(p<0.05或p<0.01)。
4.14. YJSB Improved the Antioxidant Capacity in Alcoholic HF Rats
模型组肝匀浆MDA、ROS升高，SOD、GSH-Px、CAT活性下降(p<0.01)；YJSB中、高剂量组SOD、CAT活性升高、MDA降低(p<0.05或p<0.01)，各剂量组GSH-Px活性升高、ROS降低(p<0.01)，表明YJSB增强抗氧化酶系活性、减轻脂质过氧化。
4.15. Western Blotting Method for Detecting the Regulatory Effect of YJSB on Proteins in Rat Liver Tissue
模型组肝组织TGF-β1、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3蛋白表达显著上调(p<0.01)，YJSB各剂量组较模型组显著下调(p<0.05或p<0.01)。
4.16. YJSB Reduced Smad4 Expression in the Nuclei of Hepatocytes From Rats With Alcoholic HF
免疫荧光显示模型组肝细胞核Smad4绿色荧光强度显著升高(p<0.01)，YJSB各剂量组核内Smad4表达较模型组显著降低(p<0.05)。
4.17. YJSB Can Inhibit the Activation of the TGF-β1/Smad in HSC-T6 Cells
TGF-β1诱导HSC-T6后P-Smad2/3显著升高(p<0.05或p<0.01)，LY2157299及YJSB均降低P-Smad2/3；两药联用抑制更显著；外源TGF-β1可部分但非完全逆转YJSB对P-Smad2/3的下调，P-Smad2/3仍低于模型组(p<0.05)，证实YJSB抗纤维化作用至少部分通过抑制TSSP实现。
讨论与结论总结
酒精性HF中酒精代谢产生活性氧(ROS)激活Kupffer细胞与HSCs，促进TGF-β1分泌并结合TGF-βRⅡ/Ⅰ，磷酸化Smad2/3并与Smad4入核启动COL-I、COL-Ⅲ等ECM基因转录。研究人员发现YJSB显著降低血清肝损伤酶(ALT、AST)及纤维化标志物(HA、PⅢNP、COL-Ⅳ、LN、Hyp)，下调肝组织α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ，病理染色证实减轻炎症细胞浸润与胶原/网状纤维沉积；qPCR阵列提示DEGs富集TGF-β1通路，YJSB下调TGF-β1、CTGF等促纤维化基因，上调抗氧化基因CYP2E1、CAT；YJSB同时降低炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)并提升抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)、降低MDA与ROS；Western Blotting示YJSB下调肝组织TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3及核Smad4，体外HSC-T6实验中YJSB抑制TGF-β1诱导的Smad2/3磷酸化且该抑制可被TGF-βR1抑制剂协同增强、被外源TGF-β1部分挽救，确证其主要通过抑制TGF-βR1活化—下调TSSP—抑制HSC活化与ECM沉积—并伴随抗炎及抗氧化应激效应发挥抗酒精性HF作用。
结论(翻译)：综上所述，本研究揭示YJSB具有抗酒精性HF的药效学作用，可恢复肝功能并有效对抗酒精引起的HF相关损伤。其作用机制可能涉及通过调控TGF-β1/Smad信号通路(TSSP)抑制炎症级联反应及减轻氧化应激效应，从而阻碍酒精性HF的进展。
