发酵谷物饮品的高通量微生物组特征分析：基于生产商及批次差异的洞察

《Metabarcoding & Metagenomics》：High-throughput microbiome profiling of fermented grain drinks: insights across manufacturers and batches

　　

微生物群落是发酵食品安全、一致性和功能特性的基础；然而传统培养法难以全面表征不同生产商及批次间的群落组成。分子方法可对微生物群落组成和功能进行快速、非培养依赖性的分析。为深入解析微生物群落，研究人员采用高通量宏条形码(metabarcoding)技术对来自7家欧洲生产商的发酵植物基饮品浓缩物中的细菌和真菌群落进行表征。样品于两个时间点采集，代表独立生产批次。细菌群落通过16S rRNA基因扩增子测序分析，真菌群落通过内部转录间隔区2(internal transcribed spacer 2, ITS2)扩增子测序分析。分类学谱辅以功能评估，以标记与发酵相关的有益菌属及具潜在腐败或安全风险的菌属。细菌群落以乳酸菌(lactic acid bacteria)为主，包括乳杆菌属(Lactobacillus spp.，如嗜酸乳杆菌L. acidophilus)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)和乳酸球菌属(Lactococcus spp.)，以及双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)等益生菌属。检测到低丰度的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等有潜在安全意义的分类单元序列。真菌群落以发酵酵母——酿酒酵母属(Saccharomyces spp.)为主，同时存在镰刀菌属(Fusarium)等环境类群，其中部分种具产霉菌毒素潜能。细菌和真菌群落组成均因生产商和批次而异；但生产商效应对细菌群落的影响显著更强，解释了74.8%的细菌方差，而真菌仅为35.4%。上述结果表明，结合功能评估的宏条形码技术可作为常规微生物监测的初始预警系统，并能追踪不同批次及市场间群落组成与一致性，从而提升发酵食品生产中的品质洞察力。

论文解读：发酵谷物饮品的高通量微生物组特征分析——基于生产商及批次差异的洞察

该研究由Michelle Scriver、Anastasija Zaiko、Rūta Gudaityt?与Aurelija Samuilovien?合作完成，发表于《Metabarcoding》。

一、研究背景与目的

发酵食品定义为核心是通过目标微生物生长及酶促转化实现基质转变，其微生物群落驱动生化转化，影响营养、感官特性及安全性。目前工业标准多依赖培养法检测目标菌种或常见病原菌，该法仅提供窄谱信息，难以捕获慢生长或低丰度类群，限制了对批次一致性和新兴风险的评估。高通量测序(high-throughput sequencing, HTS)中的扩增子宏条形码(amplicon metabarcoding)可在非培养条件下解析微生物群落广度与结构。欧洲立陶宛市售发酵植物/谷物基浓缩饮品日益流行，但其微生物组全景及跨厂商、跨批次变异尚不清楚。本研究旨在应用16S rRNA及ITS2宏条形码表征7家生产商两批次产品菌群，比较厂商及批次差异、评估批次一致性并进行功能分类，为发酵饮品品质监控提供依据。

二、主要关键技术方法

研究人员采集立陶宛7家生产商(M1–M7)市售发酵谷物/植物基浓缩饮品各两个独立生产批次样品（每批次3个生物学重复），离心富集菌体后使用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取总DNA。细菌16S rRNA基因V3–V4区及真菌ITS2区分别用特异性引物进行PCR扩增建库，于Illumina NextSeq 2000平台测序。生物信息学流程用cutadapt去引物，DADA2(denoising algorithm to infer amplicon sequence variants)推断扩增子序列变体(amplicon sequence variant, ASV)，16S比对SILVA数据库(138.2版)、ITS2比对UNITE数据库(10.0版)进行物种注释，按阴性对照最大值去污染。抽平(rarefy)标准化（16S rRNA至67900条、ITS2至1250条），剔除稀有ASV(<50条)。α多样性用Kruskal–Wallis检验及Dunn's事后检验，β多样性基于Bray–Curtis相异度做主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)并以PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)检验厂商、批次及其交互效应。细菌功能注释用FAPROTAX数据库，真菌用FUNGuild，并按发酵有益、潜在有害、不良(undesirable)、中性、未分配进行分类。

三、研究结果

Sequence data and microbial biodiversity overview（序列数据与微生物生物多样性概览）

经质控去污后，16S rRNA数据集获6352987条读长(1332 ASVs)，ITS2获1295070条(133 ASVs)；部分真菌样本因低丰度被剔除。抽平并去稀有ASV后，16S rRNA保留375 ASVs，ITS2保留65 ASVs。细菌优势属为乳杆菌属(Lactobacillus)、干酪乳杆菌属(Lacticaseibacillus)、发酵乳杆菌属(Limosilactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)等，低丰度检出产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；真菌优势属为酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、镰刀菌属(Fusarium)、马拉色菌属(Malassezia)等环境或植物相关酵母及霉菌。

Microbial compositional data（微生物组成数据）

不同生产商及批次优势菌属比例差异明显——M3批1、M4、M5批1、M6中Lactobacillus占41%–85.5%；M1以Lacticaseibacillus(39.1%)和Sporolactobacillus(34.3%)为主；M7以Weizmannia(>50%)为主；M2批2以Clostridium(72.1%)为主；M3批2以Acetobacter pasteurianus(56.1%)为主。多数产品(除M2批2、M3批2、M7)≥50%菌属为乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)。真菌方面Pichia见于所有厂商至少一批次（M3达100%），Malassezia在M7(51.0%)、M2批2(50%)、M1批2(59.3%)占优，Fusarium在M4批1占96.1%，Saccharomyces在M1批1约71.1%。同厂商两批次间细菌优势属可发生翻转（如M3批1 Lactobacillus 58.6%→批2 17.5%，Acetobacter从0.78%升至56.1%；M5批1 Lactobacillus 85.5%→批2 13%，Limosilactobacillus上升），真菌优势属亦存在批次更替。

Comparison between manufacturer and production time points（生产商与生产时间点的比较）

细菌观测ASV数厂商间差异显著(Kruskal–Wallis, p=7.14E-06)，真菌无显著差异(p=0.396)。PERMANOVA显示厂商(细菌p=0.001, 真菌p=0.001)、批次(细菌p=0.001, 真菌p=0.023)及二者交互(细菌p=0.001, 真菌p=0.024)均显著。厂商效应对细菌群落方差贡献达74.8%，批次2.52%，交互20.7%（合计98.02%）；真菌厂商贡献35.4%，批次4.33%，交互15.8%（合计55.53%）。PCoA图中细菌样品按厂商明显聚类，真菌聚类较弱仅M3较独立，表明细菌群落受生产商工艺影响更强。

Functional analysis and categorical assignment of microbes（微生物功能分析与分类赋值）

基于FAPROTAX与FUNGuild的功能分类显示，大多数可鉴定细菌ASV为有益(与发酵、肠道关联、固氮相关)，潜在有害菌一般<1%，但M6两批次及M3批1潜在有害或不良类群偏高（M6批2达84.3%为潜在有害/不良，含Clostridium tyrobutyricum及Anoxybacillus flavithermus），需进一步验证。真菌多归类为混合功能(Mixed)或中性，M4、M5、M6中具机会致病潜能类群（如Fusarium、Issatchenkia）比例较高，但因ITS分辨率限制需谨慎解读。

四、讨论与结论总结

讨论指出，制造商效应主导细菌群落结构，批次效应及交互亦显著，反映生产工艺与原料影响；部分厂商(如M4)批次间LAB主导稳定，说明受控工艺可获重现性。低丰度检出Clostridium及Fusarium提示需原料控制与针对性验证。宏条形码可作初筛预警，后续建议结合qPCR/PMA–qPCR(活菌鉴别)、全长ITS/长读长测序及鸟枪法宏基因组(shotgun metagenomics)提升菌株分辨率与功能基因探测。结论为：本研究通过16S rRNA及ITS2宏条形码揭示7厂商两批次发酵谷物饮品微生物组特征，厂商间及批次间均存在差异但核心有益菌群可保持稳定；提出分级监控体系——(1)常规培养法检指示菌/致病菌；(2)周期性16S/ITS宏条形码追踪群落趋势与异常；(3)针对标签宣称益生菌做菌株特异性qPCR/活力检测，对谷物相关产毒真菌做LC–MS/MS霉菌毒素筛查——将宏条形码与靶向分子方法整合可实现对发酵饮品生产批次的可重现监控、新现类群检测及功能潜力评估。