与精神分裂症相关的糖蛋白Adamtsl3调控神经元周围网的形成、维持及成年期皮层可塑性

《Molecular Psychiatry》：Schizophrenia-associated glycoprotein Adamtsl3 regulates perineuronal net formation, maintenance, and adult cortical plasticity

　　

神经元周围网（perineuronal nets，PNNs）在出生后关键期内调控表达小清蛋白的（parvalbumin-positive，PV⁺）中间神经元成熟，并在此后持续支持其功能。PNN的破坏与精神神经疾病（如精神分裂症）有关，但关键的内源性PNN调控因子仍不清楚。该研究鉴定出与精神分裂症相关的糖蛋白Adamtsl3是PV⁺细胞自主性的PNN完整性调控因子。研究人员结合小鼠遗传学、形态学与生物化学分析表明，无论在出生后早期还是成年阶段删除Adamtsl3，均会导致PNN缺陷。机制上，Adamtsl3调节基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotease-9，MMP9）活性；删除Adamtsl3会导致MMP9水平升高、PNN减少、Otx2摄取下降以及PV⁺细胞氧化应激增强。通过药理学抑制MMP9，可挽救MMP9过度活化及PNN减少。于PV⁺中间神经元中删除Adamtsl3揭示了其在调控PNN完整性中的细胞自主性功能。值得注意的是，在成年PV⁺细胞中条件性删除Adamtsl3可重新激活类似幼年期的眼优势可塑性。上述结果表明，Adamtsl3是持续存在且PV⁺细胞特异性的PNN调控因子，并对精神分裂症的病理生理机制具有直接意义。

该论文发表于《Molecular Psychiatry》，聚焦精神分裂症相关风险基因ADAMTSL3在初级视皮层（primary visual cortex，V1）细胞外基质稳态中的作用。研究背景在于：神经元周围网（perineuronal nets，PNNs，包裹特定神经元胞体和树突近端的特化性细胞外基质）主要缠绕表达小清蛋白的PV⁺抑制性中间神经元，是关键期（critical periods，CPs）关闭、抑制性回路稳定以及兴奋/抑制平衡维持的重要结构基础。既往研究表明，PNN受损与精神分裂症、阿尔茨海默病及脆性X综合征等疾病相关，但内源性、持续作用于PNN形成和维持的分子调控因子仍缺乏明确界定。另一方面，基因组关联研究已将ADAMTSL3与精神分裂症风险联系起来，但其是否通过调控PNN和PV⁺中间神经元功能参与疾病机制，尚未得到系统验证。因此，开展本研究的必要性在于从分子、细胞和回路层面阐明Adamtsl3如何影响PNN稳态，并解释精神分裂症相关遗传变异可能如何指向皮层抑制性回路异常。

研究人员围绕Adamtsl3在V1中的定位、对PNN形成与维持的作用、其与基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotease-9，MMP9）的功能联系，以及对成年皮层可塑性的影响展开研究。结果表明，Adamtsl3定位于PNN，并且既是出生后发育阶段PNN成熟所必需的因子，也是成年期PNN维持所必需的持续性调控分子。其作用具有PV⁺细胞自主性，机制上通过抑制MMP9活性来维持PNN完整性。缺失Adamtsl3会造成MMP9活性升高、PNN关键成分减少、PV⁺细胞Otx2摄取下降、氧化应激增加，并削弱抑制性神经传递。更重要的是，在成年PV⁺细胞中删除Adamtsl3足以重新开启类似幼年期的眼优势可塑性，说明Adamtsl3-MMP9轴是成年皮层经验依赖性可塑性的关键“制动器”。这些结论的重要意义在于，将精神分裂症风险基因与细胞外基质重塑、PV⁺中间神经元功能障碍和皮层异常可塑性直接联系起来，为理解精神分裂症的病理生理基础提供了分子框架，也提示MMP9可能成为干预PNN破坏相关疾病的潜在靶点。

就主要技术方法而言，研究人员综合应用了条件性基因敲除小鼠模型、AAV介导的时空特异性基因删除、免疫组织化学与近超分辨率Airyscan共聚焦成像、Western blot、共免疫沉淀、明胶酶谱（gelatin zymography）、RNAscope原位杂交、电生理全细胞记录以及成年小鼠单眼遮蔽（monocular deprivation，MD）联合视觉诱发电位（visual evoked potentials，VEP）检测。体内研究主要采用Adamtsl3^flox/flox小鼠、PV-Cre小鼠及其杂交后代，队列包含雌雄平衡的C57BL/6背景小鼠；体外机制实验采用HEK293T细胞和原代大鼠海马神经元培养体系。

**Adamtsl3 localization to PNNs is crucial for their maturation and maintenance in V1**
研究人员首先检测Adamtsl3在成年V1中的表达分布，发现其在各皮层层次的PV⁺细胞中表达明显，在主细胞中表达较低且具有层特异性，与小胶质细胞和星形胶质细胞标志物无明显共定位。进一步通过Wisteria floribunda agglutinin（WFA）和aggrecan共染色，证实Adamtsl3斑点状信号与PNN标志物存在空间共定位，说明Adamtsl3与成年V1中的PNN密切相关。随后，研究人员在P0向Adamtsl3^flox/flox小鼠侧脑室注射Cre病毒，于关键期起始和成熟阶段评估PNN，发现L2/3层PV⁺细胞周围WFA和aggrecan信号在P17、P21、P24及P30均显著下降，提示Adamtsl3参与PNN成熟。进一步利用他莫昔芬诱导型Cre在关键期关闭后删除Adamtsl3，结果在P90仍观察到WFA和aggrecan下降，说明Adamtsl3不仅参与发育期PNN形成，也对成年期PNN维持必不可少。通过主细胞特异性与中间神经元特异性删除的对比，研究人员发现主细胞中删除Adamtsl3不影响PNN，而中间神经元中删除则显著降低PNN强度，从而证明其作用具有中间神经元特异性。

**Early loss of Adamtsl3 disrupts PNN composition, Otx2 uptake, and redox balance**
为进一步分析Adamtsl3缺失对PNN组成的影响，研究人员在早期删除Adamtsl3后检测多种PNN核心分子。结果显示，到P90时，WFA、aggrecan和tenascin-R信号均下降，而brevican未见明显改变，表明Adamtsl3缺失并非造成PNN整体均一性丢失，而是选择性改变其分子组成。随后，研究人员考察转录因子Otx2在PV⁺细胞中的水平。由于Otx2经PNN介导摄取以促进PV⁺细胞成熟和PNN维持，结果发现Adamtsl3缺失后，在多个关键期时间点及P90，L2/3层PV⁺细胞内Otx2水平均降低。进一步Western blot显示皮层总Otx2未变而视网膜Otx2升高，支持问题主要出在PNN介导摄取受损，而非远端来源合成不足。最后，研究人员检测氧化损伤标志8-oxo-dG，发现P30无显著变化，但P90时PV⁺细胞中明显升高，提示Adamtsl3早期缺失造成的PNN破坏会在成年期累积引发氧化应激失衡。

**Adamtsl3 regulates MMP9 activity through two distinct functional domains**
为阐明Adamtsl3缺失导致PNN减少的机制，研究人员聚焦已知PNN调控蛋白酶MMP9。在原代神经元中，内源性Adamtsl3与重组MMP9出现共定位；在HEK293T细胞中进行共免疫沉淀发现，Adamtsl3与分泌到胞外、且已激活的MMP9相互作用，而在细胞裂解液中未见明显结合，说明二者相互作用主要发生于胞外环境。进一步通过明胶酶谱检测酶活，发现与单独表达MMP9相比，共表达Adamtsl3可显著降低MMP9活性，其效应与已知内源抑制因子TIMP-1相似。为明确结构基础，研究人员构建多个Adamtsl3缺失突变体，结果显示缺失富半胱氨酸间隔区或缺失C端thrombospondin repeat（TSR）10–12区域的突变体不再抑制MMP9，说明这两个结构域是Adamtsl3抑制MMP9所必需的关键功能区域。

**Adamtsl3 maintains PNN integrity via MMP9 activity**
在体验证方面，研究人员采用活化型MMP9免疫染色，发现Adamtsl3缺失后L2/3层PV⁺细胞周围活化MMP9在P17即升高，并持续至P24、P30和P90。Western blot未发现TIMP-1水平变化，说明该效应并非通过改变TIMP-1表达实现，而更符合Adamtsl3直接作为胞外MMP9抑制因子的作用模式。随后，研究人员用合成明胶酶抑制剂SB-3CT进行药理学干预。在Adamtsl3缺失小鼠中，SB-3CT处理可降低活化MMP9水平，并提升WFA、aggrecan及Otx2信号，证明MMP9过度活化是PNN受损和Otx2摄取下降的直接驱动因素，也说明Adamtsl3通过限制MMP9活性来维持PNN完整性。

**Adamtsl3 functions autonomously within PV⁺ cells**
为严格验证Adamtsl3是否在PV⁺细胞内部发挥细胞自主性作用，研究人员构建了PV细胞特异性Adamtsl3敲除小鼠（PV-KO）。在P120时，原位杂交和免疫标记均证实PV⁺细胞内Adamtsl3几乎完全缺失，而非PV神经元中表达保留；同时PV⁺细胞密度未变，说明该基因缺失不影响中间神经元迁移或存活。功能上，PV-KO小鼠L2/3层PV⁺细胞周围WFA减少，而8-oxo-dG和活化MMP9增加，直接证明Adamtsl3在PV⁺细胞内部维持PNN完整性并限制MMP9活性。

**PV cell-specific deletion of Adamtsl3 disrupts PNNs and GABAergic neurotransmission**
由于PNN破坏通常伴随PV回路生理功能异常，研究人员进一步检测PV-KO小鼠的抑制性神经传递。通过标记Synaptotagmin 2（Syt2），发现PV⁺细胞胞体上的Syt2⁺终末以及L2/3整体Syt2⁺终末均减少，提示PV至PV及PV至锥体神经元的连接受损。全细胞膜片钳记录显示，成年PV-KO小鼠L2/3锥体神经元的自发性抑制性突触后电流（sIPSC）频率和幅度均降低，说明皮层抑制驱动减弱。该结果将Adamtsl3缺失导致的PNN异常与GABA能（γ-aminobutyric acid，GABA）神经传递受损联系起来。

**Adult PV cell-specific deletion of Adamtsl3 reinstates juvenile-like plasticity in V1**
研究人员进一步检验在成年期特异删除PV⁺细胞中的Adamtsl3，是否足以重启幼年样可塑性。通过向P60–65的Adamtsl3^flox/flox小鼠V1立体定位注射S5E3启动子驱动的Cre病毒，研究人员实现了成年PV⁺细胞特异性删除。免疫染色证实Adamtsl3下降并伴随WFA显著减少，表明成年PV⁺细胞的PNN被有效拆解。随后VEP检测显示，删除Adamtsl3后成年V1基线视觉反应振幅升高，与抑制性控制减弱一致。在4天单眼遮蔽实验中，对照组成年鼠的对侧眼/同侧眼反应比值和眼优势指数（ocular dominance index，ODI）无变化，符合成年V1通常缺乏眼优势可塑性的特征；而S5E3-KO组出现显著眼优势转移，且主要由被剥夺的对侧眼反应降低所驱动，这一模式与幼年关键期小鼠相似。该结果表明，仅删除成年PV⁺细胞中的Adamtsl3，即足以恢复幼年样经验依赖性皮层可塑性。

在讨论部分，研究人员认为，本研究将Adamtsl3确立为与PNN相关的关键糖蛋白，其在V1中兼具发育期成熟促进和成年期维持功能，并通过抑制胞外活化MMP9而发挥作用。与TIMP-1不同，Adamtsl3选择性结合分泌后的活化MMP9，其抑制功能依赖富半胱氨酸间隔区和C端TSR10–12结构域。该机制为解释ADAMTSL3与精神分裂症的遗传关联提供了明确分子基础，尤其支持与C端截短相关的风险变异可能通过削弱MMP9抑制而促进过度的细胞外基质蛋白水解，最终导致PNN不稳定和PV⁺中间神经元功能障碍。讨论还指出，Adamtsl3在PV⁺细胞中的作用具有明显细胞自主性，并与Otx2内化不足、氧化应激升高和抑制性传递减弱相一致。SB-3CT部分恢复PNN和Otx2水平，提示MMP9抑制可能具有治疗潜力。与此同时，作者也强调Adamtsl3可能存在不同剪接亚型，当前抗体无法区分各亚型，因此不同亚型在PNN与突触前位点中的相对贡献仍待后续研究解析。整体而言，研究进一步支持PNN是成年皮层可塑性的“守门者”，Adamtsl3-MMP9轴则是维持关键期后皮层稳定状态的重要分子制动系统，该通路失衡可能参与精神分裂症等神经发育障碍中的异常可塑性。

研究结论可译为：Adamtsl3是与精神分裂症相关、持续存在且具有PV⁺细胞特异性的PNN调控因子。该蛋白通过抑制MMP9活性，维持V1中PNN的形成、成年期稳定性以及PV⁺中间神经元的正常功能。删除Adamtsl3会引发MMP9过度活化、PNN减少、Otx2摄取受损、氧化应激增强及抑制性回路功能下降；而在成年PV⁺细胞中删除Adamtsl3，还可重新激活类似幼年期的眼优势可塑性。因此，Adamtsl3-MMP9通路不仅是皮层细胞外基质稳态与经验依赖性可塑性的关键调控轴，也为理解精神分裂症相关PV⁺中间神经元和PNN异常提供了重要机制依据。