SET结构域蛋白FonSDG1通过调节尖孢镰刀菌白色变种的铵离子转运蛋白表达来控制其毒力

《Microbiological Research》：The SET domain group protein FonSDG1 regulates virulence through modulating the expression of ammonium permeases in Fusarium oxysporum f. sp. niveum

　　王佳静|郭萌萌|熊晓辉|高一洲|李大勇|宋凤明中国浙江省杭州市310058，浙江大学生物技术研究所，农业部作物病原菌与害虫分子生物学重点实验室摘要组蛋白赖氨酸甲基化是由一类含有SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶催化的表观遗传修饰，它能调控染色质的结构和可及性，进而影响基因表达。在本研究中，我们鉴定了西瓜枯萎病致病菌——尖孢镰刀菌白粉变种的基因组中24个可能的SET结构域群蛋白编码基因，并通过靶向缺失突变体的表型分析研究了它们在致病性中的作用。分析结果表明，包括先前已知的与致病性相关的组蛋白赖氨酸甲基转移酶Set1、Set2、Ash1和Kmt6的同源蛋白，以及尚未被研究的FonSDG1在内的五种FonSDG蛋白，对于该菌的完全致病性是必需的。这些FonSDG蛋白在真菌的营养生长、分生孢子形成、分生孢子形态、孢子萌发以及应激反应等方面发挥着不同的作用。值得注意的是，FonSDG1并不影响H3K4、H3K9、H3K27或H3K36位点的组蛋白赖氨酸甲基化。尤其的是，FonSDG1能够调控铵离子转运蛋白基因（FonMeps）的表达，其中FonMep2和FonMep4对维持该菌的完全致病性至关重要。这种调控作用是通过影响与氮代谢相关的基因来实现的。总体而言，这些发现揭示了一个由FonSDG1-FonMep2/FonMep4构成的调控模块，该模块通过氮代谢途径调控尖孢镰刀菌的致病性，同时也强调了FonSDG蛋白介导的组蛋白赖氨酸甲基化在尖孢镰刀菌致病性中的重要性，为防治作物中的枯萎病提供了潜在靶点。引言尖孢镰刀菌在十大植物病原真菌中排名第五（Dean等人，2012），是一种极具破坏性的土传病原体，它能引发棉花、番茄和西瓜等多种重要经济作物的枯萎病，对全球农业生产力构成严重威胁（Michielse和Rep，2009；Gordon，2017；Edel-Hermann和Lecomte，2019）。根据寄主特异性，尖孢镰刀菌可被分为100多种专化型，而这些专化型又可根据其感染同一植物物种内不同品种的能力进一步划分为不同种族（Lievens等人，2008）。该真菌具有半生物营养生活方式，最初在根皮层细胞中经历生物营养阶段，随后侵入维管组织，再过渡到坏死营养阶段（Gordon，2017）。尖孢镰刀菌的基因组编码了多种参与信号转导、转录调控和致病性的基因，这些基因共同决定了其致病性和寄主特异性（Ma等人，2013；Husaini等人，2018；Gutiérrez-Sánchez等人，2023）。在这些基因中，分泌到植物木质部中的效应蛋白SIX蛋白群（Rep等人，2005；de Sain和Rep，2015），以及其他效应蛋白，通过抑制宿主免疫反应来提升尖孢镰刀菌的致病性（An等人，2019；Jangir等人，2021）。此外，包括Sge1、Ftf1、Xln1、Ctf1、Ctf2、Czf1、SWI6和Rlm1在内的多个转录因子也在相互关联的信号通路中发挥作用，从而调控尖孢镰刀菌的致病性（Yun等人，2019；Ding等人，2020；Zhao等人，2020；Zuriegat等人，2021）。重要的是，最新研究显示，多种蛋白质翻译后修饰方式，如FonKin4和FolSrpk1介导的磷酸化、Ptc6和Msg5介导的去磷酸化、FonPAT2介导的棕榈酰化、Gnt2介导的N-糖基化、FolArd1和FonNatA复合体介导的乙酰化、FonPARP1介导的PAR酰化、FonSMT3介导的SUMO酰化以及2-羟基异丁酰化等，都与尖孢镰刀菌致病性的调控有关（Lopez-Fernandez等人，2015；Nunez-Rodriguez等人，2020；Fernandes等人，2021；Qian等人，2021；Li等人，2022；Xiong等人，2023；Zhang等人，2023；Azizullah等人，2024；Wang等人，2024；Gao等人，2025）。尽管已有诸多研究成果，但仍有必要进一步研究以阐明尖孢镰刀菌致病性背后的调控网络和分子机制。组蛋白翻译后修饰可通过重塑染色质结构和可及性来调控基因转录（Allis和Jenuwein，2016；Seni等人，2023）。其中，组蛋白赖氨酸甲基化是一种高度保守的表观遗传机制，也是在植物病原真菌中研究最为广泛的翻译后修饰之一（Freitag等人，2017；Lai等人，2022；Zhang和Tao，2025）。这种修饰表现为赖氨酸残基的单甲基化、双甲基化或三甲基化，主要发生在组蛋白H3的K4、K9、K27和K36位点上，其催化过程由特定的组蛋白赖氨酸甲基转移酶完成（Dubey和Jeon，2017；Freitag等人，2017；Zhang和Tao，2025）。这类甲基转移酶包括一类含有保守的Su(var)3-9、Zeste增强子E(z)结构域和Trithorax（SET）结构域的蛋白质，以及不含SET结构域但专门负责H3K79甲基化的DOT1蛋白（Zhang和Ma，2012；Zhou等人，2020）。长度通常为130–150个氨基酸的SET结构域是SET结构域群蛋白的典型特征，这类蛋白在真核生物中广泛存在（Zhang和Ma，2012；Zhou等人，2020）。例如，在拟南芥中已鉴定出47种SET结构域群蛋白，而在酿酒酵母中则有12种（Ng等人，2007；Freitag等人，2017）。一些SET结构域群蛋白以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供体，催化组蛋白的位点特异性单甲基化、双甲基化或三甲基化，作用位点包括H3K4、H3K9、H3K27、H3K36和H4K20，从而对基因转录产生不同的调控作用（Herz等人，2013）。此外，还有一些SET结构域群蛋白可以作用于非组蛋白底物，或者其功能尚不完全清楚（Freitag等人，2017；Seni等人，2023）。尽管非常重要，但除了四种已较为熟知的组蛋白赖氨酸甲基转移酶外，大多数SET结构域群蛋白仍缺乏深入研究。在真菌中的四种组蛋白赖氨酸甲基转移酶中，酿酒酵母的ScSet1负责H3K4甲基化（Roguev等人，2001）。在稻瘟菌、禾谷镰刀菌、环纹镰刀菌、富士镰刀菌、黑粉菌属真菌以及草酸青霉中，也已鉴定出ScSet1的同源蛋白，它们参与多种基础生理过程、代谢活动以及致病性相关功能（Roguev等人，2001；Liu等人，2015；Pham等人，2015；Gu等人，2017b；Janevska等人，2018b；Li等人，2019；Meng等人，2022）。通常与活跃转录相关的H3K36甲基化，在酿酒酵母和粗糙脉孢菌中由Set2调控（Krogan等人，2003；Adhvaryu等人，2005）。然而，包括稻瘟菌、禾谷镰刀菌、环纹镰刀菌、富士镰刀菌以及草酸青霉在内的丝状真菌，通常拥有两种不同的组蛋白赖氨酸甲基转移酶Set2和Ash1，它们共同调控H3K36甲基化，进而影响菌丝生长、分生孢子形成以及致病性（Cao等人，2016；Gu等人，2017c；Bicocca等人，2018；Janevska等人，2018a；Li等人，2019；Ren等人，2021；Xu等人，2024；Han等人，2025）。H3K9和H3K27的甲基化则与转录抑制相关（Zhang和Tao，2025）。在粗糙脉孢菌中，DIM-5负责H3K9的双甲基化和三甲基化（Tamaru和Selker，2001；Gessaman和Selker，2017），而环纹镰刀菌、灰葡萄孢、斑点链格孢、核盘菌以及芒果镰刀菌中的DIM-5同源蛋白则主要负责H3K9的三甲基化，这类修饰会影响真菌的生长、渗透压应激反应以及致病性（Soyer等人，2014；Zhang等人，2016；Gu等人，2017a；Atanasoff-Kardjalieff等人，2021；Qin等人，2024）。KMT6是一种关键酶，负责调控H3K27me3的分布，它在多种真菌中都有报道，包括粗糙脉孢菌、禾谷镰刀菌、增殖镰刀菌、富士镰刀菌、稻瘟菌、黑粉菌属真菌以及小麦核腔菌。它在真菌的致病性、基础生理过程以及次级代谢过程中都起着重要作用（Connolly等人，2013；Basenko等人，2015；Schotanus等人，2015；Studt等人，2016；Chettri等人，2018；Meng等人，2021；Zhang等人，2021；Lin等人，2022；Wu等人，2022；Studt-Reinhold等人，2024）。此外，在禾谷镰刀菌、富士镰刀菌以及小麦核腔菌中，唯一的真菌KMT5负责H4K20的甲基化，同时调控菌丝生长、次级代谢产物的生成以及致病性（Bachleitner等人，2021；M?ller等人，2023）。尽管对病原真菌中的组蛋白赖氨酸甲基转移酶已有较多了解，但尖孢镰刀菌中SET结构域群蛋白的功能仍未明确。真菌拥有复杂的代谢机制，能够优先利用氨或谷氨酰胺等简单氮源，以满足其在生长、发育、应激适应以及致病过程中的能量需求（Conrad等人，2014；Tudzynski，2014）。铵离子转运蛋白是一类负责吸收氨（NH4+）的氮转运蛋白，而氨是主要的无机氮源（von Wirén等人，1997）。在酿酒酵母中，Mep2是主要的铵离子传感器，而Mep1则参与检测铵离子的可用性（Van Nuland等人，2006）。在铵离子浓度较低的情况下，Mep2还能调控假菌丝的生长，并在调节菌丝生长方面发挥重要作用（Lorenz和Heitman，1998；Rutherford等人，2008a）。类似地，在裂殖酵母中，Amt1和Amt2，在白色念珠菌中，Mep2，在新型隐球菌中，Amt2，都能通过调控铵离子的运输和信号传导，来控制氮饥饿条件下菌丝的生长（Mitsuzawa，2006；Rutherford等人，2008b；Dabas等人，2009；Biswas等人，2025）。在植物病原真菌中，紫葡萄孢在生长和发育过程中会差异性地表达铵离子转运蛋白基因，而在富士镰刀菌中，MepB则负责调控赤霉素和bikaverin的生物合成（Hughes和Perlin，2005；Teichert等人，2008）。在禾谷镰刀菌中，Mep2和Mep3对于在铵离子缺乏条件下的正常菌丝生长以及在对小麦的致病性方面都是必不可少的（Hu等人，2022）。在玉米黑粉菌中，Ump2会与信号蛋白Rho1发生物理相互作用，且与交配基因座的相关成分存在遗传关联，因此在低铵环境下控制该菌的二形性生长、交配以及致病性方面起着关键作用（Smith等人，2003；Paul等人，2014；Paul等人，2018；Wallen等人，2021）。然而，植物病原真菌在致病过程中铵离子转运蛋白的调控机制及其功能作用仍不明确。尖孢镰刀菌白粉变种是引发西瓜枯萎病的病原体，这种疾病对全球西瓜产业构成了严重威胁（Martyn，2014；Everts和Himmelstein，2015）。在本研究中，我们对Fon中的24个SET结构域群蛋白编码基因进行了全面分析，并通过靶向缺失突变体的表型分析，研究了它们在西瓜上的致病性中的作用。研究结果表明，包括Set1、Set2、Ash1和Kmt6的同源蛋白以及FonSDG1在内的五种FonSDG蛋白，是该菌实现完全致病性所必需的。我们还发现，FonSDG1能够调控铵离子转运蛋白基因（FonMeps）的表达。此外，FonMep2和FonMep4也对维持该菌的完全致病性至关重要，这一作用很可能通过与氮代谢相关基因的调控来实现。总体而言，这些发现加深了我们对组蛋白赖氨酸甲基化在真菌致病性中作用的理解，同时也为防治作物中的枯萎病提供了潜在的靶点。研究片段真菌菌株及培养条件本研究使用的Fon菌株ZJ1最初是从中国浙江省的一株患病西瓜植株中分离得到的，根据其对不同西瓜品种的致病性，该菌株被归类为1号种族的成员（Gao等人，2022），该菌株被保存在实验室中，用作生成靶向缺失突变体的野生型菌株。真菌菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA；1升去离子水中加入200克马铃薯、20克葡萄糖、10克琼脂，pH值为7.0）以及最小培养基（MM；0.45...）上进行培养。Fon中FonSDG的鉴定及缺失突变体的构建为了鉴定Fon中的SET结构域群蛋白，我们首先使用Pfam（PF00856）、SMART（SM000317）和InterPro（IPR001214）提供的查询序列，针对尖孢镰刀菌白粉变种和尖孢镰刀菌番茄变种的基因组数据库进行了基于SET结构域的HMMER搜索。最终共鉴定出24个编码潜在SET结构域含蛋白的基因（见表1）。这些基因分布在13条染色体上，其中3个基因位于1号、5号、8号和9号染色体上，2个基因位于...讨论作为重要的表观遗传机制，组蛋白甲基化在植物病原真菌中起着至关重要的作用（Zhang和Tao，2025）。SET结构域是存在于组蛋白赖氨酸甲基转移酶中的催化性甲基转移酶结构域，在原核生物和真核生物中都具有保守性，包括植物、动物和真菌（Herz等人，2013；Lai等人，2025）。一项针对1000多种真菌物种的大规模比较研究显示，SET结构域群蛋白具有进化动态性，其含量与...资助本项工作得到了中国财政部和中国农业农村部中国农业研究系统的支持（项目编号：CARS-25）。CRediT作者贡献说明熊晓辉：方法学、研究工作。郭萌萌：研究工作。王佳静：初稿撰写、研究工作、正式分析、数据整理、概念设计。宋凤明：审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源提供、项目管理、资金获取、正式分析、概念设计。李大勇：监督、方法论、形式分析。高一洲：方法论、调查。利益冲突声明作者声明不存在利益冲突。