用于评估生物制剂滞留与黏膜吸收的食管组织筛选系统

《Nature Biomedical Engineering》：Oesophageal tissue screening system for assessing the retention and mucosal absorption of biologics

　　

食管给药面临独特挑战，包括因重力导致的快速通过催吐反射时间以及复层扁平未角化上皮的存在。为此，研究人员开发了一种食管组织筛选系统，该系统由特制定制平板（用于模拟重力效应）和离体食管黏膜组织组成，以快速识别可增强食管给药的辅料配方。利用该筛选系统，研究人员建立了辅料库，鉴定出最有效的非毒性渗透促进剂（permeation enhancers, PEs），并筛选出能够延长食管黏膜滞留时间的配方。研究人员发现一种吸收促进剂可使模型药物（4 kDa）在猪组织中的食管转运提高876倍。该配方在人食管组织以及猪的体内模型中均得到验证，分别使用模型药物和英夫利昔单抗（infliximab, 149 kDa）证明了其增强渗透性的能力。研究人员还表征了该方法的作用机制，发现其能够在不破坏食管组织细胞结构的前提下增强药物递送。该食管组织筛选系统在高通量筛选有效食管药物递送系统方面显示出良好前景。

食管炎症性疾病在全球范围内呈上升趋势。针对这一情况，近年来开发了多种干预措施，包括通过增加黏度实现食管靶向递送，以及针对这些疾病发病机制中特定免疫通路的治疗药物持续研发，如抗肿瘤坏死因子（anti-tumour necrosis factor, anti-TNF）制剂和抗白细胞介素（interleukin, IL）-4受体α疗法等生物制剂。尽管这些生物制剂具有高效性和高特异性，但肠外给药仍是主要给药途径，这可能影响患者依从性和治疗效果。因此，开发生物药物的非侵入性给药策略过去几十年来一直是制药研究的"圣杯"。鉴于口服途径长期以来是首选且最便捷的给药方式，口服生物制剂的开发日益受到关注。大多数促进生物制剂递送的配方方法旨在增强远端小肠的生物药物递送，而对上消化道（gastrointestinal, GI）的大分子递送仅限于口腔和胃黏膜，使得食管成为该领域中研究不足的部分。

食管靶向给药对大小分子治疗药物均提出诸多挑战。由于重力作用，食管腔的药物通过时间短暂（通常少于14秒），加之食管的自然清除机制，使得延长药物暴露时间变得困难；同时，由复层扁平未角化上皮构成的食管黏膜是药物渗透和吸收的重要屏障，尤其对大分子而言。现有食管疾病治疗方案要么具有侵入性，如食管狭窄的病灶内类固醇注射，要么采用非靶向制剂，如嗜酸性食管炎（eosinophilic oesophagitis, EoE）的治疗。EoE是一种慢性免疫介导的炎症性疾病，治疗选择包括以黏稠悬液形式吞咽的局部类固醇（布地奈德口服混悬液，EOHILIA）、从计量吸入器给药的氟替卡松，以及皮下给药的抗体（DUPIXENT，度普利尤单抗）。度普利尤单抗是目前美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）唯一批准用于EoE对症治疗的生物制剂，最近获批用于1-11岁儿童。然而，其伴随注射部位反应、结膜炎、上呼吸道感染、关节痛和面部潮红等副作用。此外，皮下注射途径的应用也可能受患者接受度和/或依从性限制，尤其对针头恐惧者。非靶向制剂可能导致临床效果不佳，影响患者生活质量并增加医疗成本。这些问题在EoE中尤为突出，该病过去二十年来已成为上消化道发病的常见原因，以食管损伤（包括狭窄性疾病）、吞咽困难、食物嵌顿、烧心或胸痛为特征，在儿童和成人中均有发病，以35-44岁患者发病率最高。

此前研究聚焦于通过开发医疗器械（支架和薄膜）、黏附性剂型或延长唾液药物浓度的剂型来增加食管药物滞留。增加药物在作用部位的滞留时间至关重要，但与此同时增强药物黏膜摄取而不损害组织完整性同样关键。然而，后一方面尚未得到系统探索，尤其是对大分子治疗药物而言。

基于此背景，研究人员开发了食管组织筛选（oesophageal tissue screening, OTiS）平台，以支持开发能在食管延长滞留并增加大分子化合物黏膜摄取的剂型。该工作流程包括三个核心部分：高通量 interrogation 平台开发、用于增强大分子治疗药物的配方库理性设计，以及重力敏感型药物配方评估系统。

**关键实验技术方法**

样本来源：猪食管组织取自当地屠宰场；人食管组织来源于美国国家疾病研究互换中心（National Disease Research Interchange, NDRI）的6例已故捐献者（3男3女，5例白人和1例黑人，年龄28-62岁），组织标本（10 cm）取自下段胸食管及胃食管交界部部分区域。

主要技术方法包括：组织学与免疫组织化学/免疫荧光染色技术（检测Claudin 4、E-cadherin等紧密连接蛋白和黏附连接蛋白，评估黏膜完整性）；离体渗透性实验（使用24孔定制渗透板和垂直板装置，模拟重力效应和模拟唾液清除作用，通过荧光标记物如异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran, FD4）、不同分子量的葡聚糖及罗丹明B等评估表观渗透系数P_app）；冷冻保存与组织完整性验证（液氮速冻，组织学确认上皮、固有层和黏膜肌层结构保存良好）；辅料高通量筛选（101种不同类别化学实体）；机器学习解释方法（XGBoost模型结合SHAP值分析分子特征对渗透增强效果的贡献）；流变学表征（频率扫描、时间扫描、应变扫描和剪切速率扫描评估水凝胶黏弹性和黏膜黏附特性）；钙离子络合检测（紫檀香SW显色法测定游离Ca²⁺浓度）；以及大动物体内验证（半直立位猪模型，内镜下给药，内镜监测配方滞留，组织活检采集，免疫组化评估抗体摄取和紧密连接蛋白变化，血清酶联免疫吸附测定检测全身暴露）。

**研究结果**

**OTiS渗透系统的构建与验证** 研究人员设计并制造了由透明树脂打印的24孔定制渗透板，利用磁力密封组织条带，几何形状模拟Franz扩散池。通过交替孔加载异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FD4，分子量4,000 Da）验证无孔间泄漏。比较液氮和液氮冷却异戊烷两种速冻方法，确定液氮速冻为优选方法（避免有机溶剂）。冷冻保存组织结构的完整性经组织学确认，三种荧光探针（FITC、FD4和罗丹明B）的表观渗透系数与新鲜组织处于同一数量级。渗透性阈值研究表明，大于10 kDa的亲水性化合物无法穿透组织，而高亲脂性罗丹明B表现出显著更高的渗透性。

**以渗透促进剂二元混合物克服食管黏膜屏障** 通过离体渗透性筛选，研究人员鉴定出多种可将FD4渗透性提高数百至数千倍的辅料。组织学评估排除了部分强效但破坏黏膜屏障完整性的促进剂（如100 mM鹅去氧胆酸钠盐和50-100 mg/mL癸酸钠）。最终确定安全有效的渗透促进剂包括25 mM鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid, CDC）、100 mg/mL辛酸钠和100 mM胆酸钠（sodium cholate hydrate, SCH），分别使FD4表观渗透系数提高180倍、394倍和1,390倍。二元混合物（binary mixture, BM）筛选显示，25 mM CDC与100 mM SCH组合具有最强协同效应（协同指数S>1），使FD4的P_app提高1,806倍，且不损害组织完整性。该BM对更高分子量模型化合物（最高至2,000 kDa的FD2000和IgG）均有效，BM效果优于单一促进剂。

**机器学习解释渗透增强性质的机制** 采用XGBoost梯度提升树模型，以40个最相关的理化性质为输入预测渗透增强值，通过TreeExplainer提取SHAP值。全局分析表明，电子分布和极性相关性质（MinAbsPartialCharge、MinPartialCharge、fr_C_O_noCOO）对预测渗透增强有正向贡献；而分子三维结构复杂度相关性质（NumRotatableBonds、FractionCSP3）呈负向影响。对于顶级表现的胆盐（SCH和CDC），电子分布是最大贡献因素；而对于SNAC，电子分布与三维结构效应存在冲突，其有利的电子分布可补偿不利的三维结构性质。

**配方策略** 研究人员选择生物黏附性水凝胶配方以克服重力效应和食管自然清除机制。通过流变学测试评估多种天然或半合成多糖，发现纤维素衍生物形成的水凝胶较弱且黏度较低。

**生物黏附性ι-卡拉胶水凝胶延长食管滞留** 流变学时间扫描显示，3% w/v ι-卡拉胶和3.5% w/v刺梧桐胶水凝胶在与黏膜接触时储能模量显著增加，其中ι-卡拉胶表现更优。垂直板配置模拟解剖位向和唾液清除效应的滞留实验中，这两种水凝胶表现出最低累积洗脱率和最长滞留时间。X射线影像证实3% w/v ι-卡拉胶水凝胶对组织的黏附滞留优于硫酸钡水性混悬液对照。

**生物黏附性ι-卡拉胶水凝胶增强猪和人食管离体大分子渗透性** 在同时模拟重力效应和唾液清除的垂直板装置中，含BM渗透促进剂的3% w/v ι-卡拉胶水凝胶（命名为Oeso-gel）使FD4表观渗透系数达9.23×10^-4±0.9×10^-4 cm/h，显著高于其他配方。Oeso-gel在猪食管中使FD4渗透性提高876倍，在人食管中提高285倍，两种组织间无统计学差异，验证了猪食管作为人食管离体模型的适用性。组织学检查和紧密连接蛋白免疫组化显示Oeso-gel未破坏人食管黏膜完整性。

**Oeso-gel对紧密连接旁转运的影响** 紧密连接（tight junctions, TJs）和黏附连接（adherens junctions, AJs）是调控亲水性大分子旁细胞转运的关键结构。免疫组化和免疫荧光显示，Oeso-gel处理后Claudin 4和E-cadherin的膜定位几乎检测不到，但无细胞脱落或广泛组织损伤，提示上皮基本架构保持完整。基于钙离子（Ca²⁺）对维持紧密连接完整性的关键作用，以及胆盐已知的Ca²⁺结合特性，研究人员提出Oeso-gel通过螯合游离Ca²⁺导致连接复合物构象重组。体外Ca²⁺敏感染料实验证实，25 mM CDC和100 mM SCH可近乎完全耗竭游离Ca²⁺。

**Oeso-gel在大动物模型中增强食管滞留和英夫利昔单抗黏膜摄取** 在半直立位猪模型中，内镜下给药后Oeso-gel良好黏附于食管壁，均匀覆盖管腔周径，4小时后仍保持良好滞留。组织活检无组织学异常。E-cadherin免疫组化显示2至4小时染色强度进行性下降，第3天恢复，证明该机制的可逆性。英夫利昔单抗免疫组化阳性染色最早在Oeso-gel给药后2小时出现于黏膜基底层，4小时强度相当，3天后仍可检测到，表明抗体持续黏膜滞留。无渗透促进剂的水凝胶对照组未观察到明显染色增加。TNF染色与英夫利昔单抗摄取共定位。两组动物血清中均未检测到英夫利昔单抗。

**吸管装置的制备用于长期储存和给药** 研究人员设计了基于吸管的给药装置以实现自我给药和长期稳定。比较静态混合器设计（吸管清洁器型、金属球型和螺旋型），球型混合器和吸管清洁器型混合效果最佳，再水化后水凝胶的黏弹性和黏膜黏附特性与新鲜制备对照相当。

**讨论与研究结论**

EoE可显著影响患者生活质量，导致吞咽困难、食物嵌顿、胸痛和烧心等症状。目前FDA批准的治疗药物仅有EOHILIA（布地奈德口服混悬液）和Dupixent（皮下给药的度普利尤单抗）。局部类固醇停药后疾病通常复发，而注射疗法在慢性疾病中可能存在依从性问题，尤其在年轻患者中。

本研究旨在解决生物制剂非侵入性食管靶向递送方法存在的空白，开发了以ι-卡拉胶为载体、胆盐二元混合物（25 mM CDC和100 mM SCH）为渗透促进剂的口服黏稠黏附性水凝胶Oeso-gel。该配方能够延长药物在食管吸收性上皮的滞留时间，并在胆盐存在下促进大分子化合物的旁细胞转运。

研究人员选择黏稠液体配方，这是管理EoE患者吞咽困难的成熟策略。ι-卡拉胶作为食品工业中广泛使用的增稠、稳定和凝胶剂，形成的黏稠水凝胶表现出优异的黏膜黏附特性。在模拟重力和唾液清除效应的定制垂直板装置中，该多糖基水凝胶在离体条件下于食管黏膜滞留至少4小时。体内大型动物模型进一步验证了这一发现，半直立位猪给药后4小时仍保持全食管滞留。此前研究表明，基于聚乙烯醇的薄膜在健康志愿者食管滞留时间仅为15分钟。

延长滞留时间有助于增强药物吸收，但大分子的旁细胞转运受相邻细胞间紧密连接的尺寸选择性调控。通过定制渗透板进行离体渗透性筛选，研究人员鉴定出对食管安全有效的大分子渗透促进用胆盐二元混合物。大量证据表明胆盐可增强亲水性药物的旁细胞转运。其机制包括胆盐胶束与钙离子结合或与膜脂质相互作用。紧密连接的渗透性受多种外源性和细胞内刺激动态调控，钙是其中的关键调节因子。钙依赖性细胞黏附主要由钙黏蛋白家族介导，细胞外钙水平也影响紧密连接组装。低钙水平通过从E-钙黏蛋白细胞外结构域位移钙离子而破坏黏附连接，导致构象改变和重新分布。Oeso-gel中的胆盐二元混合物可能通过结合钙离子增强大分子通过旁细胞途径的渗透。这一机制通过体外Ca²⁺敏感染料得到验证，显示胆盐致完全离子络合；同时通过离体和体内紧密连接蛋白可视化得到确认，体内研究显示该渗透增强作用具有可逆性，给药3天后观察到细胞连接再形成。

最重要的是，本研究首次证明Oeso-gel体内给药后可增强英夫利昔单抗的黏膜摄取并与TNF共定位，使用剂量低至1 mg/ml，且黏膜抗体滞留可持续3天。英夫利昔单抗已在溃疡性结肠炎、克罗恩病和类风湿关节炎等慢性炎症疾病中证明有效。尽管TNF被认为是EoE炎症反应级联中的关键介导因子，但英夫利昔单抗针对EoE的临床疗效证据仅限于三项男性成人研究（5 mg/kg体重，两次输注），未显示明显症状减轻。本研究发现局部应用于食管可在较低抗体剂量下实现增强摄取，提示这种替代给药模式可考虑用于EoE患者的临床评估。

研究人员提出以药物吸管为概念的给药方法，灵感最初来自儿科药物递送，以促进长期储存和给药便利。

未来需进行临床评估以确定Oeso-gel黏度对健康人和吞咽困难患者吞咽反应运动学的影响，从而明确吞咽安全的最佳黏度范围。本研究体内实验中动物处于镇静状态，已知镇静可影响食管运动功能，难以准确反映正常蠕动；加之猪与人食管在解剖生理上的差异，可能影响Oeso-gel所受的机械力。因此，未来临床评估中需纳入实时影像或测压监测以更准确评估主动蠕动对水凝胶滞留和转运的影响。此外，基于当前工作显示的增强局部摄取和滞留结果，未来研究值得评估肽类和蛋白质治疗药物通过食管的全身吸收潜力，作为生物制剂给药的温和替代途径。

**研究结论**：Oeso-gel作为一种非侵入性、可自我给药的食管靶向药物递送平台，在增强抗体治疗药物的黏膜摄取和滞留以治疗食管疾病方面具有巨大潜力。