重连致癌信号通路实现转移性癌症的精准消融——基于ErbB癌基因选择性溶瘤病毒（ErbB-OSV）的构建与体内疗效研究

《Nature Biomedical Engineering》：Rewiring oncogenic signalling to precision ablation of metastatic cancer

　　

摘要：尽管近年来有所进展，以卵巢癌为代表的转移性癌长期生存率仍受限于靶向治疗的脱靶毒性和免疫治疗低响应率。已有合成蛋白被设计用于选择性识别致癌信号状态，但其在体内治疗转移性疾病的作用尚不明确。针对由ErbB家族受体酪氨酸激酶（RTK）如EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生长因子受体）和HER2（Human Epidermal growth factor receptor 2，人表皮生长因子受体2）驱动的肿瘤，研究人员利用工程化蛋白限制一种临床批准病毒骨架的复制，使其仅杀死具有异常ErbB信号的细胞。由此产生的ErbB癌基因选择性病毒（ErbB oncogene-selective virus，ErbB-OSV）较同家族基准溶瘤病毒安全性更优，且在HER2/ErbB2阳性卵巢癌异种移植模型中疗效更佳。在晚期卵巢癌同源模型中，ErbB-OSV联合化疗并通过B细胞耗竭实现重复给药，较单纯化疗生存获益提升180%，而单药ErbB-OSV可治愈大部分早期病例。因此，利用合成信号蛋白理性限制病毒复制于ErbB高活化细胞，可产生高度特异的治疗制剂，较现有疗法更有效地在体内消融转移性肿瘤。

论文解读：《Rewiring oncogenic signalling to precision ablation of metastatic cancer》发表于《Nature Biomedical Engineering》

一、研究背景与立项依据

转移性癌尤其是上皮源性癌（Carcinoma）是导致癌症相关死亡的主要原因，超过90%的癌症死亡源于转移或播散性疾病。目前标准治疗方案（手术+化疗+靶向/免疫）在转移性卵巢癌、乳腺癌等中长期生存率低，5年生存率不足40%。现有ErbB家族（EGFR/ErbB1、HER2/ErbB2）靶向手段——包括单克隆抗体（如曲妥珠单抗Trastuzumab）、抗体偶联药物（ADC，如Trastuzumab Deruxtecan，T-DXd）及小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）——存在两大局限：一是正常细胞亦表达ErbB受体，治疗剂量与毒性剂量重叠导致脱靶毒性；二是绝大多数患者最终产生耐药导致疾病进展。此外，传统溶瘤病毒（Oncolytic Virus，OV）如水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）ΔM51株虽经减毒但仍可在正常细胞中有限复制引起毒性，且其溶瘤作用常依赖肿瘤固有干扰素（IFN）缺陷，许多肿瘤（如卵巢癌细胞）具备完整IFN信号故产生抵抗。此前开发的RASER（Rewiring Aberrant Signalling to Effector Release，异常信号重连至效应物释放）系统可利用磷酸化ErbB（pErbB）触发效应蛋白释放，但未与可自我扩增的溶瘤病毒整合。本研究旨在将ErbB-RASER系统引入RNA病毒生命周期，构建仅在pErbB(+)肿瘤细胞内复制的ErbB癌基因选择性病毒（ErbB-OSV），以解决特异性差与脱靶毒性问题，并评估其单独及联合标准化疗在免疫缺陷/同源免疫活性小鼠模型中的安全性和有效性。

二、主要关键技术方法

研究人员首先构建腺病毒5（Ad5）及水泡性口炎病毒（VSV，Indiana株）的RASER调控版本：将VSV磷蛋白（Phosphoprotein，P）作为RASER效应分子，P是VSV RNA依赖的RNA聚合酶大亚基（L）发挥功能所必需，删除原有P基因并在基因组中插入双顺反子编码ErbB-RASER组件（含pErbB结合结构域Vav1-SH2及HCV NS3蛋白酶体系），使膜锚定型底物在pErbB诱导邻近效应下被蛋白酶切释放游离P启动病毒复制。通过改进RASER底物/蛋白酶表达比例获得第二代病毒VSV–ErbB-RASER2（命名为ErbB-OSV），并引入mScarlet3-NanoLuc双报告基因。体外检测采用人源癌细胞系（SKOV3、BxPC3、SKBR3等pErbB(+)及MDAH2774、MIAPaCa2、MCF7、MRC5正常人细胞）、小鼠同源ID8-Neu^V664E（转导组成型活化小鼠ErbB2/Neu V664E突变）及NIH-3T3成纤维细胞，以TKI（Lapatinib）或NS3蛋白酶抑制剂（Asunaprevir，ASV）验证ErbB依赖性。体内实验使用NOD scid gamma（NSG）小鼠皮下/腹腔移植人癌细胞建立腹膜转移模型，C57BL/6J小鼠腹腔接种ID8-Neu^V664E建立免疫活性同源模型；重复给药组联用抗小鼠CD20单抗（B细胞耗竭）防止中和抗体产生；治疗组设ErbB-OSV、VSV-ON-ΔM51（对照溶瘤VSV）、卡铂+紫杉醇（SOC化疗）及联合组；通过荧光素酶（FLuc/NanoLuc）活体成像监测肿瘤负荷与病毒复制，Kaplan–Meier法分析生存期，计算EC₇₅（75%有效浓度）与CC₂₅（25% cytotoxic浓度）定量特异性指数。

三、研究结果

Engineering adenovirus for selective toxicity to pErbB(+) cells（构建对pErbB(+)细胞选择性毒性的腺病毒）

研究人员尝试用ErbB-RASER控制Ad5的E1A转录以限制复制，获得Ad5-ΔE3-ErbB-RASER-N。该腺病毒选择性杀伤pErbB(+) BxPC3胰腺及SKOV3卵巢癌细胞，且可被Lapatinib阻断；但对pErbB(+)细胞的杀伤效力弱于亲本Ad5-ΔE3，提示DNA病毒需新转录启动复制致动力学较慢，因而转向RNA病毒VSV改造。

Engineering VSV for selective toxicity to pErbB(+) cancer cells（构建对pErbB(+)癌细胞选择性毒性的VSV）

将RASER-P系统引入VSV得到VSV–ErbB-RASER1，该病毒在pErbB(+) BxPC3、SKOV3、SKBR3细胞中有效复制并抑制生长，在pErbB(-) MIAPaCa2、MDAH2774、MCF7细胞及人MRC5肺成纤维细胞中无复制与毒性；Lapatinib或ASV分别阻断ErbB磷酸化及NS3蛋白酶活性可废除病毒复制，证实严格依赖ErbB信号及RASER蛋白酶切。将该策略换用Grb2-SH2域识别磷酸化Met（pMet）亦成功构建Met-RASER限制型VSV，证明RASER控VSV可推广至其他致癌通路。

Safety and efficacy of VSV–ErbB-RASER1 in vivo（VSV–ErbB-RASER1体内安全性与疗效）

NSG小鼠中VSV–ErbB-RASER1最大耐受剂量（MTD）≥10¹⁰TCID₅₀，较野生型VSV（MTD 10⁶）高10,000倍，较VSV-YFP-ΔM51（MTD 10⁹）高10倍。在BxPC3胰腺癌及SKOV3卵巢癌腹膜转移异种移植模型中，VSV–ErbB-RASER1（MTD）较VSV-YFP-ΔM51（MTD）显著抑制肿瘤生长并延长生存期（卵巢癌模型平均生存期延长41天，P=0.0007），而VSV-YFP-ΔM51在MTD下无显著生存获益。

Rational improvement of VSV–ErbB-RASER potency（理性提升VSV–ErbB-RASER效价）

优化RASER组件表达框得VSV–ErbB-RASER2（ErbB-OSV）。ErbB-OSV在pErbB(+)癌细胞中毒性等同VSV-ON-ΔM51，对MRC5成纤维细胞CC₂₅较VSV-ON-ΔM51高30倍（6.0 vs 0.20 TCID₅₀），特异性指数（CC₂₅/EC₇₅）达35.3（VSV-ON-ΔM51为2.5）。共培养实验中ErbB-OSV选择性清除pErbB(+) SKOV3细胞而不影响MRC5，VSV-ON-ΔM51则无差别杀伤二者。Lapatinib或ASV均可废除ErbB-OSV对肿瘤细胞的杀伤，确认机制依赖ErbB磷酸化及RASER P蛋白释放。

Safety and efficacy of ErbB-OSV monotherapy against metastatic ovarian cancer in vivo（ErbB-OSV单药治疗转移性卵巢癌体内安全性与疗效）

NSG小鼠中ErbB-OSV MTD ≥3×10⁹TCID₅₀（VSV-ON-ΔM51 MTD 10⁹）。在SKOV3异种移植模型中，低于MTD的ErbB-OSV（10⁹TCID₅₀）即较VSV-ON-ΔM51（MTD）更显著抑制肿瘤生长、维持体重并延长生存期（部分小鼠长期存活），解剖证实ErbB-OSV仅于肿瘤组织内复制。连续传代深度测序显示ErbB-OSV突变频率与分布同VSV-ON-ΔM51无差异，无获得性高复制优势突变。

ErbB-OSV synergizes with chemotherapy to extend survival in metastatic ovarian cancer（ErbB-OSV与化疗协同延长转移性卵巢癌生存期）

SKOV3异种移植模型中，ErbB-OSV（MTD）+卡铂+紫杉醇联合组较单药持续压制肿瘤荧光信号，中位肿瘤信号较单药更低，联合组平均生存期237天 vs 化疗159天、ErbB-OSV 115天、对照组79天（P<0.05）；43%联合组小鼠长期存活，且联合用药未增加体重丢失（无叠加毒性）。体外加药实验显示亚致死浓度化疗使ErbB-OSV EC₇₅降低2.9–6.7倍，证实协同作用。

Adding ErbB-OSV to chemotherapy extends survival in a syngeneic ovarian cancer model（在同源卵巢癌模型中ErbB-OSV联合化疗延长生存期）

构建ID8-Neu^V664EpErbB(+)小鼠卵巢癌细胞系，ErbB-OSV选择性杀伤之（CC₂₅/EC₇₅=345 vs VSV-ON-ΔM51 141）。C57BL/6J小鼠延迟治疗模型（接种2周后给药）中，抗CD20单抗保障ErbB-OSV六次重复给药后仍能检测到病毒复制；联合组较化疗alone生存期延长180%（79天 vs 28天增益，P=0.0006）。早期治疗模型（接种1周后给药）中ErbB-OSV单药或联合化疗使所有小鼠肿瘤根除并长期存活（>30周），化疗单药仅1/4治愈。

Early ErbB-OSV treatment produces a high rate of permanent cancer eradication（早期ErbB-OSV治疗可实现高比例永久性肿瘤根除）

在ID8-Neu^V664E同源模型早期干预（肿瘤负荷小时），单次ErbB-OSV或联合化疗即可完全清除肿瘤，所有处理小鼠>30周无复发，验证了足量病毒接触肿瘤细胞时的根治潜力。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出：ErbB-OSV通过合成生物学重连ErbB致癌信号至病毒复制，不同于传统基于IFN敏感性减毒的溶瘤VSV（如ΔM51、VSV-IFNβ-NIS），其安全性源于对致癌信号通路的特异性识别而非增强宿主IFN应答，故不易受肿瘤IFN信号完备所限制；其复制不依赖细胞周期故可与细胞周期阻滞型化疗（卡铂+紫杉醇）协同且无附加毒性。B细胞耗竭（抗CD20）可有效克服溶瘤病毒重复给药时中和抗体清除问题，且不损害抗肿瘤T细胞免疫。ErbB-OSV是首个被证实添加到卡铂/紫杉醇双药化疗可显著提升转移性癌生存期的直接溶瘤杀伤制剂，区别于仅具免疫调节作用的ICI/贝伐珠单抗。局限性包括尚未在HER2+乳腺癌等其他ErbB驱动癌中验证、未定量全身生物分布、免疫活性模型中适应性免疫对疗效的具体贡献待阐明。

最终研究结论（翻译自Discussion末段总结）：

综上，研究人员构建了基于VSV的ErbB癌基因感应病毒（ErbB-OSV），将ErbB过度活化重连至病毒复制与细胞死亡。ErbB-OSV延长含HER2/ErbB2阳性卵巢癌转移的免疫缺陷小鼠生存期，优于基准溶瘤VSV，证实其抗肿瘤活性不依赖适应性免疫。研究人员进一步引入抗CD20处理以保障免疫活性宿主体内多次给药时效能。ErbB-OSV联合标准化疗较任一单药生存延长超两倍，在早期同源模型中单药ErbB-OSV可治愈多数病例。ErbB-OSV满足了系统性给药疗法超越现有标准改善转移性癌生存的长期需求。此研究表明利用合成蛋白与工程病毒可高选择性自主识别并杀伤携特定致癌信号的细胞，为精准肿瘤消融提供了新范式。