通过重构WNT7B拇指与食指结构域（thumb and index domains）开发源自WNT的骨合成代谢多肽用于骨骼衰老与骨折治疗

《Nature Biomedical Engineering》：Developing WNT-derived bone anabolic peptides for skeletal aging and fracture by reconstructing thumb and index domains of WNT7B

　　

WNT蛋白是骨骼健康的关键调节因子，但开发WNT相关的骨合成代谢（bone anabolic）制剂在临床上面临挑战且成本高昂。本研究通过AlphaFold赋能的序列预测及计算机分子对接筛选，鉴定出重构的人WNT7B拇指与食指结构域（reconstructed thumb and index domains of WNT7B, WNT7BRTID）为一种WNT来源的骨合成代谢多肽。在老年小鼠及猪骨质疏松模型中，WNT7BRTID多肽通过提高间充质基质/干细胞（mesenchymal stromal/stem cells, MSCs）的成骨潜能并促进骨再生，显示出治疗潜力。研究人员利用单细胞测序（single-cell RNA sequencing）、转基因谱系示踪（transgenic lineage tracking）及生化手段发现，WNT7BRTID可激活组织内残留MSCs的功能并促进其向成骨谱系分化，无需MSCs移植即可有效修复临界尺寸缺损（critical-sized defect）。机制上，WNT7BRTID通过RECK/G蛋白偶联受体124（G protein-coupled receptor 124, GPR124）激活非经典Ca2+–活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT，此处指NFATc1）信号通路来介导其骨合成代谢效应，该过程不依赖于已知具致癌风险的经典Wnt/β-连环蛋白（canonical Wnt/β-catenin）信号。研究结果表明，WNT7BRTID可通过Ca2+–NFAT信号促进MSCs功能，有望作为缓解衰老相关骨丢失及促进骨折愈合的骨合成代谢制剂。

论文解读：通过重构WNT7B拇指与食指结构域开发骨合成代谢多肽用于治疗骨骼衰老与骨折

《Nature Biomedical Engineering》刊登的此项研究针对目前骨质疏松症（osteoporosis）、骨骼老化、骨折及各类骨量丢失缺乏理想合成代谢（anabolic）解决方案的临床困境展开。现有临床应用的甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH 1-34, teriparatide）存在有效时间短、潜在脱敏、老龄敏感性下降等局限；而经典Wnt/β-catenin信号激动剂（如romosozumab及重组WNT3A）虽能增加骨形成，却因广泛激活经典Wnt/β-catenin信号带来致癌风险及心血管不良事件隐患，制约了其安全应用。WNT7A/7B既往被报道可在骨组织中通过非经典途径促进成骨且不激活致癌性β-catenin转录，但其天然蛋白需复杂翻译后修饰（棕榈油酰化），重组全长功能蛋白制备昂贵困难。基于此，研究人员提出从WNT7B中鉴定具有骨合成代谢活性的短肽并解析其非经典作用机制，以克服现有疗法缺陷。

为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：①基于AlphaFold2的WNT7B三维结构预测及滑动框全序列—重构序列计算机分子对接（in silico docking）筛选，从人WNT7B天然及重构肽段中筛选高亲和RECK（reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs）的候选肽；②采用生物层干涉术（bio-layer interferometry, BLI）、分子动力学模拟验证肽—受体亲和力；③建立去卵巢（ovariectomy, OVX）诱导骨质疏松小鼠模型、20月龄自然衰老小鼠模型及6岁龄小型猪（相当于人类年轻老年期）骨质疏松模型，进行系统给药疗效评价，并以临床骨合成代谢药romosozumab（Romo）为阳性对照；④构建羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）/还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide, rGO）支架局部固定WNT7B^RTID，建立小鼠及小型猪股骨临界尺寸骨缺损（critical-sized defect）模型评估原位骨再生；⑤采用Nfatc1-CreER; tdTomato及3.6kb-Col1α1-EGFP转基因小鼠进行体内MSCs谱系示踪；⑥移植区细胞进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）解析细胞群落变化；⑦基因敲低（siRNA knockdown of RECK, GPR124, CnA）、钙荧光探针（Fluo-8 AM）检测胞内Ca²⁺流入、免疫印迹检测磷酸化/总NFATc1及两步共免疫沉淀（two-step coimmunoprecipitation, TIP）验证RECK–GPR124复合物形成等生化实验阐明信号机制。

WNT7B^RTIDhas bone anabolic activity independent of canonical Wnt signalling

通过对WNT7B thumb（Aa 201–217）、index（Aa 323–336）及linker结构域进行组合重构与对接打分筛选，获得唯一优于天然linker结构域结合RECK的候选肽WNT7B^RTID（重构thumb-index域）。分子对接与分子动力学结合自由能计算显示WNT7B^RTID对RECK亲和力显著高于Frizzled（Fz）受体，而WNT3A对应域强结合Fz但不结合RECK。人骨髓MSCs（human MSCs, hMSCs）中TOP-flash报告基因及RT–qPCR证实WNT7B^RTID不激活经典Wnt/β-catenin信号及靶基因；Alizarin Red S（ARS）染色与成骨基因（ALPL, COL1A1, RUNX2, SP7）RT–qPCR显示WNT7B^RTID强烈诱导hMSCs成骨分化，单独thumb或index无此功能，证明其为不依赖经典Wnt通路的骨合成代谢肽。

WNT7B^RTIDalleviates osteoporosis in small and large adult mammals

OVX诱导骨质疏松小鼠模型经腹腔给予PEG化WNT7B^RTID（1.25 mg/kg/天，2月）后，micro-CT（μCT）显示骨体积分数（bone volume/total volume, BV/TV）、骨矿物密度（bone mineral density, BMD）、骨小梁数目（trabecular number, Tb.N）回升，骨小梁分离度（trabecular separation, Tb.Sp）降低，优于或等同于Romo对照组。20月龄自然衰老小鼠给予WNT7B^RTID4月后μCT证实有效抑制年龄相关性骨丢失，骨髓脂肪细胞与破骨细胞减少、成骨谱系细胞增多，Nfatc1-CreER; tdTomato; 2.3kb-Col1α1-EGFP小鼠谱系示踪显示NFATc1⁺MSCs向成骨谱系定向增强。6岁龄小型猪系统给药3月后，远端股骨髓端及皮质骨μCT参数（BV/TV, BMD, Tb.N, 皮质骨孔隙率）均改善，证实WNT7B^RTID可缓解大型哺乳动物老年性骨丢失，长期（3月系统给药、6月局部植入）未见肿瘤形成及明显毒副反应。

Enhanced bone formation of MSCs by engineered WNT7B^RTID

将WNT7B^RTID通过酰胺键接枝于rGO表面并复合HA多孔支架（HA/rGO–WNT7B^RTID），FTIR、XPS、TGA证实成功嫁接及60天稳定性。hMSCs在支架上成骨诱导14天及21天，扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）、透射电镜（transmission electron microscope, TEM）、高分辨TEM（high-resolution TEM, HRTEM）及X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）显示rGO–WNT7B^RTID组较对照（rGO–NH₂）形成更成熟羟磷灰石（hydroxyapatite, HA）结晶结节，能谱（energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS）显示Ca、P元素含量更高，表明工程化WNT7B^RTID可在局部增强MSCs矿化与成骨。

Engineered WNT7B^RTIDrepairs critical-sized defects in small and large adult mammals

小鼠股骨临界尺寸缺损植入HA/rGO–WNT7B^RTID支架，1周免疫荧光见Cd200⁺、Cd51⁺、Cd44⁺、Pdgfra⁺、Prrx1⁺、Sox11⁺MSCs标志物及Col1α1-EGFP⁺成骨后代增多；2周Ki67⁺示MSCs增殖增强，GFP⁺成骨细胞增多；2月μCT与X线示缺损完全愈合，对照组未愈合。小型猪股骨髁φ10×6 mm临界尺寸缺损植入后6月，Masson–亚甲蓝酸性品红（methylene blue–acid fuchsin, MBAM）组织学及μCT显示rGO–WNT7B^RTID组广泛骨整合与新骨形成并恢复运动功能，对照组仅纤维组织充填伴支架排异，证实局部工程化WNT7B^RTID可有效修复大动物临界尺寸骨缺损。

Single-cell elucidation of WNT7B^RTIDenhancing bone regeneration

移植后1月取猪缺损区支架消化细胞行scRNA-seq，发现WNT7B^RTID组MSC谱系（MSC1, MSC2, mesenchymal progenitor cells, MPCs及早成骨细胞）显著多于对照组，伪时间分析示MSC1/MSC2为成骨祖源。细胞互作推断（CellPhoneDB）显示WNT7B^RTID组重建并增强了BMP、TGF-β、FGF、非经典Wnt等成骨相关细胞间通讯网络，且MSC谱系内基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）未见经典Wnt/β-catenin通路激活，明确体内成骨效应由β-catenin非依赖途径介导。

WNT7B^RTIDactivates Ca²⁺/NFATc1 signalling in MSCs by Reck/Gpr124 signalosome

体内缺损区活化β-catenin（activated β-catenin, ABC）免疫荧光无差异，经典Wnt抑制剂DKK1/SFRP1不阻断WNT7B^RTID成骨作用。分子对接示WNT7B^RTID与RECK形成多个氢键（hydrogen bond interactions, HBI），关键残基Thr16-Thr17-Gln18（TTQ）及Asn20、Lys22缺失突变肽丧失成骨诱导能力；siRNA敲低RECK取消WNT7B^RTID诱导的成骨。分选Nfatc1-CreER; tdTomato小鼠CD45^?tdTomato⁺MSCs，Fluo-8 AM检测示WNT7B^RTID促Ca²⁺内流，被RECK和/或GPR124（G protein-coupled receptor 124）共敲低阻断；TIP证实WNT7B^RTID促进RECK–GPR124异二聚体形成；Western blot显示WNT7B^RTID降低磷酸化NFATc1（Ser172），calcineurin催化亚基A（calcineurin subunit A, CnA）或RECK/GPR124敲低逆转此效应；核转位实验及钙调磷酸酶抑制剂FK506（抑制NFAT去磷酸化）分别证实WNT7B^RTID促NFATc1入核且该入核及成骨效应依赖RECK–GPR124。综上机制为WNT7B^RTID结合RECK–GPR124信号体→Ca²⁺内流→calcineurin激活→NFATc1去磷酸化入核→成骨基因表达。

讨论（结论翻译）

研究人员鉴定出WNT7B衍生的骨合成代谢多肽WNT7B^RTID，可缓解衰老及雌激素缺乏性骨质疏松，并在小动物和大动物中促进临界尺寸骨缺损的有效再生与修复。WNT7B^RTID是一种不依赖β-catenin的WNT合成代谢制剂，对小型及大型成年哺乳动物具治疗效力。传统WNT thumb与index域被认为通过结合Fz触发经典Wnt/β-catenin信号，而重构后的WNT7B^RTID选择性高亲和结合RECK而非Fz，通过RECK/GPR124激活Ca²⁺/calcineurin/NFATc1轴促进MSCs成骨分化，规避了经典Wnt通路的致癌风险。WNT7B^RTID通过增强组织内固有NFATc1⁺MSCs招募、增殖与成骨定向来发挥骨合成代谢作用，在大动物骨组织中验证了与人骨MSCs的高度相似性。长期安全性评估及进一步大型动物多器官临床前研究仍需开展，但本研究结果为开发靶向WNT的非经典通路骨合成代谢肽用以治疗骨质疏松及促进骨再生提供了概念验证与转化基础。