病毒特异性组织驻留记忆T细胞网络维持人类口腔黏膜免疫

《Mucosal Immunology》：Virus-specific resident memory T cell networks sustain immunity in human oral mucosa

　　

背景：对病毒感染的持久保护依赖于病原体入侵位点的组织驻留记忆T（TRM）细胞。口腔是一个关键的黏膜屏障，经常暴露于病毒病原体；然而，人类口腔黏膜中病毒特异性T细胞的表型特征和空间组织仍知之甚少。目的：本研究旨在明确病毒特异性T细胞如何在口腔黏膜中长期驻留，并识别支持其持续存在的细胞相互作用。方法：研究人员对七名近期从严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染康复的健康个体的血液和口腔黏膜中的预测病毒特异性T细胞进行了分析。使用单细胞RNA和T细胞受体测序、空间转录组学和免疫荧光（IF）来定义细胞组成、定位和相互作用。结果：巨细胞病毒（CMV）特异性T细胞主要为CD4⁺效应记忆T细胞，而Epstein-Barr病毒（EBV）和SARS-CoV-2特异性T细胞主要为具有细胞毒性特征的CD8⁺TRM细胞。细胞-细胞通讯分析表明，预测的病毒特异性CD8⁺TRM细胞嵌入高度交互的信号网络中，从成纤维细胞和树突状细胞接收强烈输入。空间转录组学和IF证实了CD8⁺TRM细胞、成纤维细胞和树突状细胞之间的密切关联。结论：预测的病毒特异性CD8⁺TRM细胞似乎在人类口腔黏膜中发挥突出作用，与成纤维细胞和树突状细胞的支持性通信网络可能有助于它们在这个关键屏障部位的持久性和长期存活。

论文解读文章

研究背景、存在问题与研究目的

病毒感染对全球健康构成重大威胁，SARS-CoV-2大流行尤为凸显这一点。口腔黏膜是许多呼吸道和唾液传播病毒（如冠状病毒科、疱疹病毒科等）的初始接触部位，作为关键屏障，需整合先天性及适应性免疫细胞与结构细胞以有效抵御病原体。持久抗病毒保护依赖于病原体入侵位点的组织驻留记忆T（TRM）细胞，其可在组织中长期存在。然而，目前对人类口腔黏膜中病毒特异性T细胞，特别是TRM细胞的表型特征、空间组织及其维持机制知之甚少。此前研究多基于小鼠模型，缺乏在人体组织中的直接证据。为此，研究人员对近期SARS-CoV-2感染康复的健康个体进行了研究，旨在明确病毒特异性T细胞如何维持长期驻留，并识别支持其持续存在的细胞相互作用网络。

研究人员开展的研究与结论

研究人员对7名健康志愿者（年龄26-39岁，5名女性，2名男性）进行研究，所有参与者均在SARS-CoV-2感染后1个月采样，血清抗体水平>2500 U/mL。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析4名参与者的配对血液和口腔黏膜样本，并使用空间转录组学（Visium平台）和免疫荧光（IF）对另外3名参与者进行验证。研究发现，预测的病毒特异性CD8⁺TRM细胞在口腔黏膜中占主导地位，并与成纤维细胞和树突状细胞形成高度交互的信号网络，通过纤连蛋白1（FN1）-CD44、CXCL12-CXCR4及半乳糖凝集素9（galectin-9）-CD45等配体-受体对介导的通信可能促进其持久生存。该研究成果发表于《Mucosal Immunology》，为理解黏膜抗病毒免疫的持久机制和疫苗设计提供了重要见解。

主要关键技术方法

该研究采用了以下主要技术方法：单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合T细胞受体（TCR）测序用于鉴定细胞组成和预测病毒特异性（通过匹配TCR CDR3序列至VDJdb数据库）；空间转录组学（10× Genomics Visium法）分析细胞空间定位；以及多重免疫荧光（IF）染色验证细胞共定位。样本队列来源于奥地利维也纳医科大学附属医院的7名近期SARS-CoV-2感染康复健康个体（4名用于scRNA-seq，3名用于验证实验）。所有操作均按照标准方案进行，并排除了具体的试剂和培养步骤。

研究结果

1. 研究队列的临床特征
研究人员招募了7名健康参与者（5名女性，2名男性），年龄26-39岁，均在SARS-CoV-2感染确诊后30天采样，血清抗体水平>2500 U/mL，所有参与者均接种过SARS-CoV-2疫苗，5人还接种过流感疫苗。

2. 病毒暴露供者口腔黏膜样本的细胞组成
通过scRNA-seq分析，研究人员在血液和口腔黏膜中识别出8个主要细胞类型（包括T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和成纤维细胞）。T细胞在两个组织中均占多数，但口腔黏膜中树突状细胞比例较高，而血液中自然杀伤细胞较多。IF染色显示CD45⁺白细胞主要位于黏膜下层的乳头尖附近。

3. T细胞亚型分布取决于病毒特异性
T细胞亚群分析揭示了10个转录不同的亚群，包括CD8⁺TRM、CD8⁺中央记忆T（TCM）细胞、CD8⁺效应记忆T（TEM）细胞、CD4⁺TCM、CD4⁺TEM、CD4⁺TRM Th1、CD4⁺TRM Th17、调节性T（Treg）细胞、γδ T细胞和黏膜相关不变T（MAIT）细胞。口腔黏膜中CD8⁺TRM、CD4⁺TEM和CD4⁺TRM Th1占主导，而血液中以CD4⁺TCM和CD8⁺TCM为主。IF验证了CD103⁺TRM细胞在基底膜附近富含。

4. T细胞亚型分布取决于预测的病毒特异性
通过TCR匹配至VDJdb数据库，研究人员鉴定了巨细胞病毒(CMV)-、Epstein-Barr病毒(EBV)-、甲型流感病毒(Influenza A)-和SARS-CoV-2-特异性T细胞。EBV和SARS-CoV-2特异性T细胞在口腔黏膜中富集，而CMV特异性细胞主要在血液中。口腔黏膜中病毒特异性T细胞以CD8⁺TRM和CD4⁺TEM为主，EBV和SARS-CoV-2特异性细胞中CD8⁺TRM占绝对优势，而CMV特异性细胞分布更异质（以CD4⁺TEM为主）。差异基因表达分析显示，SARS-CoV-2特异性CD8⁺TRM细胞高表达RUNX3、LAPTM5等与组织适应相关的基因。

5. 细胞-细胞通讯表明预测病毒特异性CD8⁺TRM细胞具有强烈交互特征
使用CellChat分析表明，成纤维细胞发出最强信号，而CD8⁺TRM细胞（包括病毒特异性亚群）接收最强输入。成纤维细胞主要通过细胞外基质（ECM）受体相互作用（胶原蛋白、层粘连蛋白、FN1）、趋化因子（CXCL12）和免疫细胞迁移途径发出信号；树突状细胞则通过抗原呈递（MHC II）和免疫调节（galectin-9）途径发出信号。

6. 成纤维细胞通过ECM、趋化因子和整合素介导的信号驱动通讯
空间转录组学显示成纤维细胞、树突状细胞和病毒特异性CD8⁺TRM细胞在黏膜下层共定位。CellChat分析揭示成纤维细胞与CD8⁺TRM细胞之间存在异质性通信网络，其中FN1-CD44和CXCL12-CXCR4为优势配体-受体对。IF证实CD90⁺成纤维细胞与CD3⁺CD103⁺TRM细胞紧密相邻，定量分析显示FN1⁺细胞在距离CD44⁺T细胞<50μm处显著富集。

7. 树突状细胞可能通过半乳糖凝集素-9支持CD8⁺TRM细胞维持
树突状细胞与CD8⁺TRM细胞间的通讯主要依赖MHC I类分子和galectin-9（LGALS9）。LGALS9主要结合CD45和CD44。空间转录组学和IF验证显示galectin-9⁺细胞与CD45⁺CD3⁺细胞在黏膜上层共定位，且定量分析证实galectin-9⁺细胞在CD45⁺T细胞附近显著富集，提示该轴可能促进TRM细胞稳定性。

讨论与结论总结

该研究表明，预测的病毒特异性CD8⁺TRM细胞在人类口腔黏膜中强烈存在。病毒特异性导致的T细胞分布差异可能反映不同病毒的传播途径或组织嗜性：EBV和SARS-CoV-2主要通过口腔黏膜传播，相应特异性CD8⁺TRM细胞占优势；而CMV传播途径多样，其特异性细胞以CD4⁺TEM为主并更多分布于血液。此外，预测的病毒特异性CD8⁺TRM细胞显示出多方面的交互特征，从成纤维细胞和树突状细胞接收强烈输入信号（如FN1-CD44、CXCL12-CXCR4和galectin-9-CD45），这些相互作用可能增强其在口腔黏膜中的生存和维持。研究局限包括样本量小、TCR特异性基于数据库预测而非实验验证、以及细胞通讯分析基于计算推断。尽管如此，该研究为理解病毒特异性CD8⁺TRM细胞在黏膜部位的持续存在机制提供了重要见解，对设计旨在建立持久TRM细胞群的疫苗具有价值。

结论翻译：总之，我们的数据表明，在口腔黏膜预测的病毒特异性T细胞群体中，CD8⁺TRM细胞强烈存在。T细胞分布因病毒特异性而异，可能反映了各自病毒的传播途径或组织嗜性差异。这一观点得到观察结果的支持：血液与口腔黏膜中病毒特异性T细胞的分布模式不同。研究人员进一步发现，预测的病毒特异性CD8⁺TRM细胞似乎表现出多方面的交互特征，从成纤维细胞和树突状细胞接收强烈输入信号，这可能增强其在口腔黏膜中的生存和维持。鉴于TRM细胞在抗再感染保护中的作用日益受到认可，这些发现为病毒特异性CD8⁺TRM细胞的存在及其在黏膜部位长期生存的机制提供了重要见解——这些见解可能对旨在建立持久TRM细胞群的疫苗设计具有价值。