ERO1α通过调控线粒体相关膜（MAM）动力学促进胶质母细胞瘤侵袭性与代谢可塑性

《Nature Cell Biology》：ERO1a fosters glioblastoma aggressiveness and metabolic flexibility by regulating mitochondria-associated membrane dynamics

　　

尽管组学时代已产生大量数据用于探究分子驱动因素，胶质母细胞瘤（GBM）仍是最不可治愈的恶性肿瘤之一，患者生存期中位数极低。本研究揭示了内质网与线粒体之间的动态相互作用，即线粒体相关膜（MAM），并阐明了钙离子通量及MAM结构调控如何影响GBM细胞可塑性与代谢灵活性。研究人员鉴定出ERO1α为关键MAM蛋白，其表达与GBM患者不良预后显著相关，能够调控MAM结构、动力学及钙离子介导的功能。研究数据表明，ERO1α的活性与表达在体外和体内均促进GBM侵袭性，并增强线粒体氧化磷酸化。该工作建立了ERO1α介导的MAM调控与ERO1α抑制抗肿瘤效应之间的直接联系，凸显了一种依赖于特定背景、可药物化的脆弱性，可被开发用于GBM治疗。

GBM的侵袭性与治疗失败主要归因于其高度的瘤内及瘤间异质性，这种异质性部分受到肿瘤微环境的影响。在当前治疗策略下，异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型GBM患者的5年生存率仅为5-10%。肿瘤的细胞多样性表现为层级化结构，包括具有自我更新能力、肿瘤传播能力及内在治疗抵抗机制的胶质瘤干细胞（GSCs），以及其分化后代胶质瘤分化细胞（GDCs）。在脑内，肿瘤细胞应对不同类型的应激源，形成波动的肿瘤微环境，其特征为细胞毒性化疗药物递送受限、不同梯度的氧张力及营养物质，从而产生空间异质性。鉴于这种功能失调的微环境，GBM细胞成为靶向代谢脆弱性/依赖性的理想候选者。

癌细胞中，即使在氧气存在的情况下，葡萄糖仍被导向生物合成途径和乳酸产生，这一现象被称为瓦博格效应（Warburg effect）。然而，尽管大多数GBM肿瘤表现出葡萄糖摄取增加，但并非所有肿瘤均遵循此模式，这进一步强调了其代谢异质性，为基于依赖性的治疗策略带来挑战。在代谢应激下，未折叠蛋白反应（UPR）被激活，内质网（ER）的折叠能力不堪重负。短暂和持续的ER应激均促进MAM的形成，MAM是ER与线粒体之间的特化接触位点，使两个细胞器能够进行物理和生化通讯。这种相互作用参与多种基本代谢过程，包括钙稳态、磷脂和胆固醇代谢，以及线粒体动力学和生物能量学的调控。

研究人员对经典型、前神经型和间充质型等多种GBM亚型中的MAM网络进行了研究和表征，鉴定出MAM定位蛋白ERO1α是UPR反应的关键调控因子和线粒体生物能量学的调节者。临床GBM样本及患者来源的分化细胞和干细胞分析揭示，间充质亚型特别依赖ERO1α和MAM灵活性以在应激条件下维持细胞代谢。这两个特征共同调控该GBM类型的细胞代谢，从而在应激条件下允许细胞存活。通过定义这一依赖性通路，研究数据为创新治疗策略提供了原理验证，并鉴定出可用于GBM治疗的阿喀琉斯之踵。

为探究GBM中尚未知的MAM网络，研究人员首先从三种亚型的GBM患者来源细胞中分离MAM，进行蛋白质组学分析。在所有GBM患者来源细胞中检测到的蛋白质大多属于同一蛋白质-蛋白质相互作用网络，包括已充分描述的MAM相关蛋白VDAC1/2/3、IP3R2/3、GRP75和ERO1α。通过特异性药理学手段对这些主要MAM蛋白进行敲低后评估GDCs活力，发现Grp75抑制剂Mkt-077和ERO1α抑制剂QM295以及EN460最为有效，提示这两种蛋白在GDC存活中的重要性。Mayo Clinic脑肿瘤患者来源异种移植国家资源库的基因表达分析显示，ERO1α mRNA（ERO1L）在间充质亚型中显著富集，TCGA数据也印证了这一点。此外，ERO1L在GBM中相对于正常脑组织表达更高，组织学分析也在蛋白水平确认了这种模式。值得注意的是，MCU和IP3R3显示出相似的模式。TCGA数据集的进一步分析表明，ERO1α是所鉴定基因中最佳的MAM调控因子，其mRNA表达与GBM患者不良生存显著相关，从而引导研究聚焦于ERO1α。

鉴于ERO1α在坏死周围GBM区域（对应间充质亚型）表达较高，研究人员推测这可能代表肿瘤存活和进展的关键适应性机制。通过遗传学和药理学功能缺失方法，在多种GBM患者来源细胞中验证了这一假设，将细胞置于葡萄糖剥夺条件下（该条件在这些区域常见）。所有间充质GBM患者来源细胞对葡萄糖剥夺表现出比经典型或前神经型更高的敏感性。单独EN460处理或与葡萄糖剥夺联合处理72小时也观察到类似但更为明显的模式。shRNA介导的ERO1α敲低在蛋白水平得到确认后，导致间充质亚型细胞活力显著且更明显地下降。使用Incucyte技术进行的细胞增殖实验显示，在高糖或低糖条件下EN460处理后，间充质亚型细胞增殖显著且更大幅度地减少。此外，划痕实验评估的细胞迁移在该亚型中也受到强烈抑制。Annexin V/碘化丙啶双染显示，EN460处理后24和72小时，早期和晚期凋亡细胞以及死亡细胞比例增加。

研究人员进一步研究了ER应激的激活，发现其与葡萄糖剥夺和EN460处理均相关，并与细胞内活性氧（ROS）产生的轻微增加相关（而非线粒体ROS）。在正常培养条件下，未观察到PERK（PRKR样ER激酶）通路的调控；但在葡萄糖剥夺下，检测到调控ER-线粒体接触和细胞代谢的典型PERK通路（PERK-eIF2α-ATF4-CHOP）的激活。值得注意的是，当葡萄糖剥夺与EN460处理联合时，这种激活被减弱，提示PERK通路参与特异性发生在葡萄糖剥夺条件下。鉴于ERO1α抑制对间充质亚型增殖和存活的强烈影响，研究人员探究了EN460处理是否可能重塑MAM蛋白组成。通过质谱数据分析EN460处理下MAM中显著失调的蛋白，发现细胞周期调控相关蛋白减少，而线粒体组织和细胞代谢相关蛋白富集。

ERO1α与PDI（蛋白二硫键异构酶）是催化ER中氧化蛋白折叠的关键通路的两个蛋白。由于ER的还原状态有利于ERO1α活性，研究人员使用ER-roGFP2测量ER氧化还原状态，观察到EN460处理和葡萄糖剥夺下ER氧化显著降低。ERO1α有两种主要氧化还原异构体，具有不同的电泳迁移率（Ox1和Ox2），分别代表活性和非活性状态。使用非还原凝胶通过免疫印迹评估ERO1α的还原和氧化状态，发现葡萄糖剥夺下ERO1α的氧化形式（特别是与其活性相关的Ox1）增加，而EN460阻止其氧化，这与EN460可阻止电子传递至ERO1α并将其冻结在还原状态的已知机制一致。

为深入了解ERO1α与ER和线粒体的相互作用，研究人员评估了EN460处理后的线粒体形态（包括大小和形状）以及ER与线粒体之间的距离，采用免疫荧光、电子显微镜或原位邻近连接分析。ERO1α阻断导致ER与线粒体接触长度显著减少，在Ge518中间充质细胞中还会增加距离。在低糖条件下观察到短距离（0-20 nm） proximity增加，这有利于ER与线粒体之间的钙转移。相反，EN460处理下短距离减少而长距离（30-50 nm）增加。此外，所有亚型均观察到线粒体分裂增加，但线粒体DNA未增加。因此，MAM蛋白ERO1α的抑制触发细胞活力下降，同时MAM宽度增加和线粒体分裂增加。

研究人员进一步使用Fate-1间隔子增加MAM距离，以验证是否能复制ERO1α抑制的效果。在GDC Ge518中，Fate-1感染后IP3R3和VDAC1的相互作用减少，反映ER-线粒体接触位点松散。Fate-1间隔子表达导致所有GBM患者来源细胞活力大幅下降。这些结果突出了ERO1α阻断如何影响MAM结构和ER与线粒体之间的距离，特别是在间充质GBM模型中。

ERO1α此前被报道可关闭SERCA钙泵活性并激活IP3R1，其活性依赖于氧化状态，而IP3R1在调控ER与线粒体之间钙通量方面具有重要作用。通过Fluo-8 AM探针测量钙，研究人员观察到EN460处理后在所有模型中细胞质钙池减少。使用Mito-R-GECO和4mtD3cpv探针分别评估的ER-线粒体钙转移和钙线粒体含量也受到EN460和葡萄糖剥夺的影响，但该现象在Ge518和Ge970.2中观察到，而在Ge258中未见。这些结果表明，与葡萄糖剥夺的应激条件不同，ERO1α抑制减少了向线粒体的钙转移。相反，EN460处理后ER钙池增加，而葡萄糖剥夺使其减少。与ER-线粒体相互作用测量一致，钙分析显示ERO1α抑制阻止了钙从ER向线粒体区的转移，而葡萄糖剥夺增加了MAM相互作用和ER与线粒体之间的钙转移。

鉴于MAM在磷脂合成和动力学中的作用，研究人员还研究了磷脂酰胆碱（PCs）、磷脂酰乙醇胺（PEs）、磷脂酰肌醇（PIs）、鞘磷脂（SMs）和自由脂肪酸在MAM和全细胞裂解物中的分布。虽然EN460处理下Ge970.2裂解物中未检测到磷脂调控，但Ge518裂解物中PCs、PEs和PSs减少。然而，聚焦MAM磷脂含量时，Ge518在EN460处理下未检测到显著调控，而Ge970.2显示PSs轻微但显著增加。这些数据突出表明ERO1α抑制优先在间充质亚型中调控总体磷脂含量。

ER-线粒体接触位点不仅对钙信号、细胞器动力学和脂质生物合成至关重要，对线粒体氧化磷酸化也必不可少。MAM作为"钙热点"使有效的ER到线粒体钙转移得以实现。这种钙通量刺激线粒体脱氢酶（如丙酮酸脱氢酶；PDH），从而增强三羧酸（TCA）循环衍生的还原当量并促进氧化磷酸化。 accordingly，在EN460处理下的间充质亚型MAM中发现了TCA循环相关蛋白的显著富集。使用Seahorse XFe96技术评估线粒体呼吸和糖酵解，研究人员观察到GBM细胞之间存在强烈的代谢异质性，从更有氧的（Ge904，C）、静止的（Ge970.2，C）或糖酵解的（Ge835，M）代谢，到更具能量代谢特征的类型（Ge518和Ge269，均为间充质）。在葡萄糖剥夺条件下，大多数GBM细胞表现出氧消耗率（OCR）升高的趋势。值得注意的是，ERO1α抑制导致所有GBM亚型的基础和最大呼吸显著下降或呈下降趋势。类似数据在ERO1α敲低后也在所有模型中观察到。此外，作为糖酵解指标的细胞外酸化率（ECAR）在ERO1α阻断后显著降低，但前神经型GDC Ge258仅呈趋势。代谢组学分析 highlighting了间充质GBM中EN460处理下多种代谢物（包括α-酮戊二酸和琥珀酸）的减少，证明ERO1α有利于线粒体氧化磷酸化和糖酵解，特别是在间充质GBM中。13C-葡萄糖标记揭示了ERO1α遗传学和药理学抑制后所有模型中糖酵解中间产物和糖酵解衍生代谢物（如丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸等氨基酸）以及TCA中间产物的减少。

GSCs能够在缺氧和营养匮乏的严酷脑微环境中存活，与更具侵袭性的肿瘤表型相关。研究人员首先在GSC模型中评估ERO1α表达，观察到其在间充质亚型中的富集，与GDCs中的发现一致。MAM含量分析也揭示了ERO1α在所有亚型中的存在。为更好理解ERO1α阻断对GSCs的影响，研究人员进行了类似GDCs的实验。葡萄糖剥夺降低了GDCs Ge518和Ge258的活力，但未影响Ge970.2，而EN460处理导致所有GSCs活力下降。与GDC类似，所有亚型对MAM间隔子Fate-1均高度敏感，但GSC Ge970.2（C）的敏感性较低。3D细胞侵袭实验显示，EN460处理和葡萄糖剥夺均显著降低了所有GSC的侵袭能力，尽管葡萄糖剥夺对GSC Ge518（M）的侵袭能力产生了更显著的降低。使用FRET探针FEMP测量ER与线粒体之间的距离，研究人员观察到仅在GSC Ge518中葡萄糖剥夺条件下两个细胞器之间距离更近，电子显微镜也证实了这一点，这与GDC模型中的模式一致。相反，EN460处理在所有亚型中均诱导细胞器远离，与GDCs中仅在EN460处理下观察到0-20 nm距离增加的模式相似。关于ER-线粒体钙转移，间充质亚型在EN460处理下无论葡萄糖浓度如何均显示钙通量减少，而Ge970.2（C）在葡萄糖剥夺下显示更高的钙释放率，EN460处理后减少。GSC Ge258（P）在任何实验条件下均未观察到显著变化。对于细胞质钙，EN460处理下未观察到任何调控。

同时，GSC Ge518（M）和Ge258（P）在EN460处理和葡萄糖剥夺下的OCR均显著降低，而Ge970.2（C）在EN460处理下显著降低，但在葡萄糖剥夺下有增加趋势。值得注意的是，ECAR在GSCs Ge518（M）中显示类似模式，低糖和EN460处理后显著降低，而GSC Ge970.2无论如何条件均未发现调控，仅葡萄糖剥夺影响Ge258。这些数据展示了间充质和前神经GSCs与其相应GDCs相比如何不同地响应应激和ERO1α阻断，正如GSC在低糖条件下24小时呼吸降低与ER-线粒体钙转移相关所 exemplified。

由于ERO1α活性可与其磷酸化相关，研究人员还评估了ERO1α上三个推定磷酸化位点（106、143和145位丝氨酸残基）的状态。针对p106、p143和p145生成的磷酸特异性抗体通过免疫印迹验证。在非还原凝胶中，观察到约120 kDa的ERO1α磷酸化，这可由二聚体形式或与其他蛋白伴侣的相互作用解释。EN460处理下，ERO1α在145和143位的激活较低，而葡萄糖剥夺诱导145位磷酸化显著增加。这些数据表明ERO1α活性与其磷酸化变化相关。为鉴定ERO1α参与MAM相互作用和功能的重要结构域，研究人员使用慢病毒shRNA转导沉默内源性ERO1α基因。关于其主要催化活性，ERO1α通过涉及其调控性（C94-C99）和催化性（C394-C397）半胱氨酸对的顺序二硫键交换氧化PDI，从而维持PDI的活性状态并促进ER中高效的氧化蛋白折叠。研究人员生成了多个点突变构建体，包括C94A-C97A（调控性二硫键位点）、S143A、S143A/S145A（均为磷酸化位点）和C394A/C397A（催化性二硫键位点），AlphaFold预测显示这些突变不影响蛋白结构。所有突变体均显著降低细胞活力。电子显微镜分析显示，ERO1α敲低和随后异位表达ERO1α突变体后MAM长度显著减少、MAM距离增加，而异位表达ERO1α-wt挽救了原始表型。功能上，ER-线粒体钙转移在所有突变体中显著降低，与观察到的OCR和ECAR减少一致。

人脑类器官作为重现人脑细胞构筑和研究生物学机制及细胞过程的强大相关模型已崭露头角。研究人员生成脑类器官并与GSC模型共培养。与葡萄糖剥夺类似，EN460显著降低了GSCs在类器官中的侵袭和增殖能力。通过实施多西环素调控系统实现ERO1α的时间性抑制，研究人员在体外蛋白水平和类器官模型中确认了生物学效应。为进一步评估体内治疗效果，研究人员在多种体内系统中评价了EN460的疗效，包括斑马鱼胚胎和携带颅内肿瘤的小鼠以及一个GBM同基因模型SB28。在斑马鱼幼虫异种移植模型中，EN460处理导致肿瘤细胞侵袭和生长显著减少。在免疫功能低下裸鼠中，饮用水中添加多西环素显著延长了生存期并减缓了肿瘤生长，这一效应在Fate-1过表达肿瘤中进一步增强。为评估EN460的体内治疗效果，研究人员在免疫缺陷裸鼠和免疫正常小鼠中均进行了实验，分别注射Ge518 GSCs和同基因SB28模型。与ERO1α敲低体内实验一致，携带Ge518或SB28肿瘤的小鼠与对照动物相比生存期显著延长，在注射Ge518 GSCs的裸鼠中观察到更明显的效应。这些结果表明，使用EN460全身性抑制ERO1α在GBM模型中提供了有治疗意义的生存获益，确立了ERO1α阻断作为一种有前景的治疗策略。

讨论部分总结：GBM侵袭性和治疗失败主要归因于其高度的瘤内和瘤间异质性，部分受肿瘤微环境影响。本研究聚焦于MAM处的ERO1α及其在GBM代谢灵活性中的关键功能，通过分析多种患者来源GDC和GSC模型，实现了对所有GBM亚型的全面深入研究。通过分离和分析MAM含量，研究人员鉴定出ERO1α是MAM功能和动力学的核心参与者。使用聚焦的MAM蛋白抑制剂文库，研究人员还鉴定出Grp75抑制剂Mkt-077作为有趣靶点，但其临床相关性有限，因为其表达与患者生存期无相关性，且需要选择性递送至GBM细胞同时避免影响正常脑实质和全身组织。

数据显示，葡萄糖剥夺后PERK信号通路激活，在EN460处理下被抑制。与此一致，研究人员观察到相同条件下PERK下游CHOP和ATF4表达的抑制。如研究所述，H₂O₂代表ERO1α氧化酶活性的副产物，可占蛋白合成期间细胞ROS产生的高达25%。因此，ERO1α氧化酶活性必须被严格调控以避免稳态下ROS积累，并在需要氧化蛋白折叠能力爆发（如应激条件下）时被快速激活。与此一致，模型中葡萄糖剥夺下观察到细胞内ROS产生增加但不显著。

值得注意的是，研究人员展示了分化细胞和干细胞模型之间的不同响应，其中钙转移增加并与葡萄糖剥夺下呼吸增强相关。GSCs中未显示调控（经典型除外），这与间充质和前神经模型中呼吸降低相关（但经典型不降低）。这种亚型间的差异可能归因于经典型模型低OCR水平。此外，间充质模型依赖葡萄糖生存，而经典型并非如此，这由细胞活力实验证实。

ERO1α表达在多种癌症类型中较高，其表达水平与癌症预后和进展相关。累积证据表明ERO1α影响肿瘤侵袭性，但目前尚无可用于临床使用的药理学抑制剂。本研究使用了两种充分验证的商业化ERO1α抑制剂EN460和QM295。EN460结合ERO1α的FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合口袋并导致FAD辅酶丢失，阻止ERO1α再氧化。由于FAD结合口袋在其他酶中保守，这带来了潜在的脱靶效应。尽管EN460在体外相对低效，靶向ERO1α可能代表一种有前景的抗肿瘤策略，正如小鼠模型中肿瘤生长的显著延迟所凸显的。

综上所述，通过揭示ERO1α与钙通量、MAM动力学/结构及细胞代谢之间的直接联系，本研究鉴定出了一种相关的可药物化脆弱性，可被开发用于GBM治疗。