细菌胞外囊泡(EV)经鼻给药使RNA货物进入脑内(Intranasal Delivery of Bacterial Extracellular Vesicles Enables RNA Cargo Entry Into the Brain)

《Journal of Extracellular Vesicles》：Intranasal Delivery of Bacterial Extracellular Vesicles Enables RNA Cargo Entry Into the Brain

　　

摘要： 细菌释放的胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是宿主-微生物相互作用的重要介质，可调节免疫反应、递送功能性分子并影响疾病进程。然而，细菌EV能否进入脑内并对宿主细胞产生功能性影响尚不清楚。本研究通过电穿孔将Cre重组酶mRNA加载至大肠杆菌来源的EV(Ec EVCre)中，评估其经鼻给药后的转运及功能性递送情况。利用mT/mG报告基因小鼠，研究人员在嗅上皮观察到EV摄取，并在嗅球(olfactory bulb, OB)部分神经元中检测到重组酶驱动的绿色荧光蛋白(GFP)表达，证明细菌EV相关mRNA可在脑内实现功能性递送。嗅觉区域的单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)及成像分析显示神经元和免疫细胞是EV的主要靶细胞。体外培养感觉神经元的微流控生物芯片实验表明，EV经信号内体(signaling endosomes)介导从突起末端向胞体发生逆行轴突运输(retrograde axonal transport)，药理学抑制显著削弱EV摄取，证实网格蛋白依赖及脂筏相关的内吞途径参与该过程。除神经元途径外，研究人员发现鼻腔黏膜中吞噬细胞(包括中性粒细胞和巨噬细胞)可吞噬EVCre并迁移入脑，提供了一条免疫介导的囊泡递送替代通路。综上，细菌EV通过神经元和吞噬细胞双重途径将功能性RNA货物递送至脑内，为微生物进入中枢神经系统(central nervous system, CNS)及神经-免疫互作提供了新见解。

论文解读：Intranasal Delivery of Bacterial Extracellular Vesicles Enables RNA Cargo Entry Into the Brain

本研究发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。中枢神经系统(CNS)曾被认为受血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)保护而免遭微生物侵袭，但近年研究发现肠道菌群或其代谢产物可通过"微生物-肠-脑轴"影响脑功能。细菌胞外囊泡(bacterial extracellular vesicles, bEVs)是革兰氏阴性及阳性菌分泌的纳米级(20–400 nm)膜性囊泡，携带蛋白质、脂质及核酸(含small RNA)，能跨界(interkingdom)调控宿主细胞。既往研究表明bEVs可穿越BBB，但经鼻(olfactory route)途径是否能使bEVs携带功能性RNA货物进入脑内、其细胞与分子机制如何，均不明确。鉴于鼻腔至脑的嗅神经通路可绕过BBB，且bEVs具有天然载体潜力，研究人员开展了此项研究，旨在明确鼻内给予bEVs能否跨越嗅上皮屏障并携载RNA至脑内发挥功能，阐明其涉及的细胞类型、转运路径及内吞机制。研究证实大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)来源EV经鼻给药后可经嗅神经逆行运输及吞噬细胞介导两条途径到达小鼠嗅球(olfactory bulb, OB)，电穿孔装载的Cre mRNA在脑内神经元中被翻译并引发报告基因重组，证明bEVs可作为非侵入性脑靶向RNA递送载体，为微生物-脑交流及新型鼻用脑部治疗策略提供依据。

主要关键技术方法：

研究人员选用7周龄mT/mG双荧光报告基因小鼠(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4(ACTB-TdTomato,-EGFP)Luo}/J)为动物模型。从E. coli DH5α培养上清中分离纯化bEVs，采用电穿孔(electroporation)法将体外转录的带核定位信号Cre重组酶mRNA(NLS–Cre mRNA)载入bEVs，经Benzonase核酸酶消化去除囊泡外非包载RNA得到EV^Cre。经鼻给予小鼠EV^Cre，设置对照(Ec EVs无Cre mRNA及PBS)。利用免疫荧光显微镜观察囊泡定位及mT/mG重组(GFP表达)；通过Olink Target 96蛋白质组学检测OB组织蛋白变化；取嗅上皮及OB制备单细胞悬液进行scRNA-seq(10× Genomics Chromium X, Seurat分析)鉴定EV靶细胞群；原代培养小鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)感觉神经元并接种于分区微流控生物芯片(microfluidic biochip)，在突起(compartment)侧施加Nile Red标记bEVs，活细胞实时成像观察逆行运输；用动力蛋白抑制素(dynasore, 动态素dynamin抑制剂)及甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin, MβCD, 脂筏破坏剂)处理DRG神经元，结合共聚焦成像与RT–qPCR评估内吞抑制效果。

研究结果：

3.1 Intranasal Administration of bEVs Enables Translocation to the OB

研究人员经鼻给予Nile Red标记Ec EVs后48 h，在OB实质内检出EV红色荧光信号而对照组无，证明鼻内给予bEVs可跨越嗅黏膜到达脑内。Olink蛋白质组学显示OB中免疫调节与神经元信号相关蛋白(S100a4, Ccl2, Ccl20等)显著差异表达，GSEA富集到细胞因子响应、髓系细胞活化等通路，表明bEVs入脑引起可检测的神经免疫微环境改变。

3.2 Cre mRNA Can be Loaded Into bEVs via Electroporation

电穿孔联合Benzonase处理后，EV^Cre粒径分布(50–200 nm)、浓度、形态(TEM)及蛋白谱(SDS–PAGE, Western blot检测GroEL)与未处理Ec EVs无差异；RT–qPCR仅在EV^Cre中检出Cre mRNA而对照组无，证实Cre mRNA被包载进囊泡腔内受Benzonase保护，bEVs结构完整且适合递送研究。

3.3 Intranasally Delivered bEVs Mediate Functional mRNA Expression in the OB

mT/mG小鼠经鼻给予EV^Cre(第1、3天，第5天取材)，嗅上皮及OB中检出Cre免疫信号及tdTomato→GFP转换(mG表达)，对照Ec EVs组无GFP。证明鼻内bEVs可将功能性mRNA递入脑内神经元并被翻译行使Cre重组酶活性，实现体内基因重组。

3.4 Single-cell Transcriptomic Profiling of Olfactory Tissues Reveals Cellular Targets of bEV-Delivered mRNA Cargo

对EV或EV^Cre处理小鼠的嗅上皮和OB进行scRNA-seq，UMAP分群识别出嗅感觉神经元、僧帽细胞(mitral cells)、中间神经元、内皮细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、中性粒细胞等。EV^Cre组特异性检出GFP(mG)转录本，分布于神经元(嗅感觉神经元、僧帽细胞等)与非神经元(巨噬细胞、中性粒细胞、基质细胞)簇，证实bEVs携带RNA可被多类嗅觉系统细胞摄取。

3.5 Phagocyte-Mediated Uptake and Brain Infiltration of bEVs

免疫荧光显示鼻腔给予Ec EVs后，EV信号与嗅上皮及OB中Iba1⁺小胶质细胞/巨噬细胞、Ly6G⁺中性粒细胞共定位，NeuN⁺神经元亦可见EV关联。说明bEVs入脑具双重途径——嗅神经元直接摄取后经轴突逆行转运，以及黏膜吞噬细胞(中性粒细胞、巨噬细胞)内吞EV后穿越筛板(cribriform plate)迁入OB。

3.6 BEVs Undergo Retrograde Axonal Transport via Signalling Endosome Pathways

DRG神经元接种微流控芯片，bEVs仅加至突起室(distal compartment)。活细胞成像显示bEVs被远端突起内吞后沿微通道向胞体室(soma compartment)逆行移动(约0.4 μm/s)，与LysoTracker标记的酸性晚期内体/溶酶体共定位。证实bEVs在神经元内经信号内体介导发生逆行轴突运输至胞体。

3.7 Endocytosis Inhibitors Block Neuronal Uptake of bEVs

原代DRG神经元与Nile Red标记bEVs共孵育后，bEVs与Rab7⁺晚期内体共定位。经dynasore(50 μM)或MβCD(80 μM)预处理显著减弱细胞内EV荧光强度及Ec-1700 small RNA检出量，且bEV诱导的TNF-α上调及Ccl20上调被抑制，神经元基因(Ntf3, Yes1, Cntn1, Clstn2)的部分抑制被逆转。表明感觉神经元摄取bEVs依赖于动态素(dynamin)依赖的内吞及膜胆固醇(脂筏)敏感途径，且该内吞是bEV RNA货物递送及后续转录响应的前提。

讨论与结论总结：

讨论指出鼻腔为CNS独特门户，嗅上皮连接外界与脑。本研究首次在体表征bEVs从鼻腔至脑的转运，并证明携带mRNA可在脑神经元中翻译发挥功能。scRNA-seq揭示神经元与吞噬细胞(中性粒细胞、巨噬细胞)均为bEV靶细胞，提出双重入脑模型：嗅神经元直接逆行运输及免疫细胞"特洛伊木马"式携囊泡跨黏膜迁入OB。微流控实验证实bEVs经信号内体逆行转运(速度~0.4 μm/s符合已知内体运输范围)，药理学抑制证明dynamin及脂筏相关内吞参与。短期鼻内给予非致病性E. coli K-12来源bEVs未引起明显神经元丢失或全身广泛炎症。研究认为bEVs既是微生物-脑轴信使也可开发为脑靶向RNA递送平台。

结论(Conclusions)：

综上所述，经鼻给予的Ec EVs跨越嗅上皮，被神经元及免疫细胞内化，并将功能性RNA递送至脑区。神经元逆行运输与免疫细胞介导的转运为CNS微生物跨界访问提供了机制解释。这些发现拓展了对宿主-微生物交流的认识，确立bEVs作为微生物群-脑轴(microbiota–brain axis)中的活跃参与者，并为开发针对神经系统疾病的非侵入性RNA递送策略提供了依据。