N端乙酰化减少帕金森病模型中的突触核蛋白病理

《Neurobiology of Disease》：N-terminal acetylation reduces synuclein pathology in models of Parkinson's disease

　　

α-突触核蛋白（α-synuclein）是帕金森病（Parkinson's disease）及其他突触核蛋白病（synucleinopathies）患者脑内发现的病理细胞内包涵体（如路易小体（Lewy bodies））的主要组成成分。尽管α-突触核蛋白的磷酸化已被广泛研究，但相对较少的研究关注其他翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs），如乙酰化，尤其考虑到N端乙酰化的α-突触核蛋白（N-terminally acetylated α-synuclein）是脑内最丰富的内源性蛋白形式。在本研究中，研究人员利用帕金森病的多种体外（in vitro）和体内（in vivo）模型，试图理解N端乙酰化α-突触核蛋白的病理后果。研究人员发现，在种子扩增实验（seed amplification assay）中，N端乙酰化延缓了α-突触核蛋白单体及预形成纤维（pre-formed fibrils）的聚集。与未乙酰化的预形成纤维相比，乙酰化预形成纤维在永生细胞系和iPSC（induced pluripotent stem cells）来源的多巴胺（dopamine, DA）神经元中的摄取速率减慢。此外，暴露于乙酰化预形成纤维诱导的内源性α-突触核蛋白播种（seeding）减少，这通过iPSC来源多巴胺神经元和小鼠脑中Serine129磷酸化α-突触核蛋白（pSyn）包涵体的积累来测定。最后，注射N端乙酰化α-突触核蛋白预形成纤维的小鼠存活时间显著长于注射未乙酰化纤维的小鼠。综合而言，该研究表明N端乙酰化减少了α-突触核蛋白的聚集、细胞摄取、内源性α-突触核蛋白的播种以及体内（in vivo）毒性，提示这一普遍的翻译后修饰代表了一种强效的、生理相关的保护机制，而这一机制在大多数帕金森病和突触核蛋白病的实验范式中迄今尚未被充分考虑。

**论文解读：N端乙酰化减少帕金森病模型中的α-突触核蛋白病理**

**研究背景与问题**
帕金森病（Parkinson's disease, PD）及其他突触核蛋白病（synucleinopathies）的主要病理标志之一是细胞内包涵体（如路易小体（Lewy bodies）），其主要成分为聚集并磷酸化的α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）及脂质和细胞器。尽管SNCA基因突变和拷贝数变异与家族性PD相关，且对α-syn的正常功能及其在PD发病机制中的作用已有较多研究，但关于α-syn翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）影响的研究相对不足。PTMs可影响蛋白质定位、活性和折叠状态。α-syn可经历多种PTMs，包括磷酸化、糖化、乙酰化、截短、SUMO化和硝化等。其中，丝氨酸129（Ser129）的磷酸化（pSyn）是路易小体的标志性标记，但N端乙酰化的α-syn（N-terminally acetylated α-syn, NAc-syn）是体内最丰富的内源性形式。已有研究表明NAc-syn聚集倾向降低，但对其细胞病理效应尤其是在PD相关疾病模型中的系统研究仍缺乏。此外，乙酰化可能影响α-syn与细胞膜的结合及细胞间传播，从而改变毒性效应。因此，本研究旨在利用多种体外和体内PD模型，阐明N端乙酰化对α-syn病理后果的影响。

**研究内容与结论**
研究人员通过种子扩增实验、永生细胞系（RPE1细胞，含SNCA敲除、野生型及过表达）和iPSC来源多巴胺神经元（来自SNCA三倍体PD患者及其同基因编辑的SNCA野生型和敲除系）的摄取与播种实验，以及M83转基因小鼠（过表达人A53T突变α-syn）的立体定位注射模型，系统评估了N端乙酰化预形成纤维（NAc-PFFs）与未修饰预形成纤维（PFFs）在聚集、细胞表面结合、内化、播种及体内毒性方面的差异。主要结论：N端乙酰化显著减缓了α-syn单体和纤维的聚集动力学；NAc-PFFs在RPE1细胞和iPSC来源多巴胺神经元中的内化效率均低于PFFs，且这一效应与内源性α-syn表达水平无关；NAc-PFFs与细胞表面的结合显著减少，且该结合依赖硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPGs）；NAc-PFFs诱导的内源性α-syn播种（以pSyn包涵体为指标）在iPSC来源多巴胺神经元和小鼠脑中均显著低于PFFs；注射NAc-PFFs的M83小鼠较注射PFFs的存活时间显著延长，且脑内pSyn病理扩散减轻。该论文发表在《Neurobiology of Disease》。

**关键技术方法**
研究采用了以下主要关键技术：1）**种子扩增实验**（seed amplification assay）：利用硫黄素T（ThioflavinT）荧光实时监测α-syn单体和纤维的聚集动力学。2）**细胞摄取与结合实验**：用Alexa Fluor 488标记PFFs或NAc-PFFs，通过高内涵成像分析RPE1细胞（SNCA野生型、敲除型、过表达型，来自ATCC）及iPSC来源多巴胺神经元（源自PD患者SNCA三倍体iPSC系及同基因编辑系，由爱丁堡大学提供）中的荧光强度。3）**细胞表面HSPG酶切处理**：使用肝素酶（heparinase I和III）预处理RPE1细胞，评估纤维结合变化。4）**小鼠脑内注射模型**：对3月龄M83转基因小鼠（Giasson et al.来源）右侧背侧纹状体注射PFFs或NAc-PFFs，进行生存分析和终点组织学检测（pSyn免疫组化及免疫荧光）。5）**免疫荧光与高内涵成像**：使用Opera Phenix共聚焦显微镜分析pSyn和酪氨酸羟化酶（TH）共定位。

**研究结果**
**3.1 未修饰与N端乙酰化α-syn预形成纤维的生化与结构特性**：通过质谱确认完全N端乙酰化，电镜和动态光散射显示PFFs和NAc-PFFs长度和粒径相似；种子扩增实验显示，乙酰化单体或纤维均显著延长聚集的滞后期并降低最大荧光值，表明乙酰化减缓了聚集动力学。

**3.2 N端乙酰化α-syn预形成纤维在RPE1细胞中内化效率降低**：在SNCA-WT、SNCA-KO和SNCA-过表达RPE1细胞中，488标记的NAc-PFFs在1小时和24小时内的摄取量均比未修饰PFFs减少约50%，且与内源性α-syn水平无关。

**3.3 胞外硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的酶切减少未修饰和N端乙酰化α-syn预形成纤维在RPE1细胞表面的结合**：冰上结合实验显示NAc-PFFs与细胞表面结合量比PFFs减少>70%；肝素酶预处理几乎完全消除PFFs和NAc-PFFs的结合，表明两者均依赖HSPGs。

**3.4 N端乙酰化α-syn预形成纤维在iPSC来源多巴胺神经元中内化减少**：在SNCA-WT、SNCA-KO和SNCA-三倍体多巴胺神经元中，6小时时NAc-PFFs的摄取显著低于PFFs，24小时时趋势相同但未达统计学显著，独立于内源性α-syn表达。

**3.5 N端乙酰化α-syn预形成纤维在多巴胺神经元中诱导的α-syn播种减少**：以pSyn强度为指标，SNCA-三倍体神经元中播种最显著；在4周和6周两个时间点，PFFs诱导的pSyn强度均高于NAc-PFFs，且差异在SNCA-三倍体神经元中更为明显。

**3.6 注射N端乙酰化α-syn预形成纤维的M83转基因小鼠存活时间更长**：生存实验中，所有PFF组小鼠在NAc-PFF组首只出现症状前已到达人道终点；终点实验显示NAc-PFF组黑质和脑桥pSyn阳性包涵体显著少于PFF组，而在注射位点（右侧纹状体）无明显差异；共定位分析显示TH阳性神经元中pSyn比例在PFF组更高（未达显著）。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究提供重要体外与体内证据，证明N端乙酰化α-syn PFFs在纤维化、细胞表面结合、内化和细胞间传播方面均具有较低倾向。NAc-PFFs的内化减少不受内源性α-syn水平影响，且可能通过降低与HSPG修饰受体的结合实现。尽管已有研究显示未修饰PFFs依赖HSPGs，而NAc-PFFs可能结合N-连接聚糖和neurexin 1β，但本研究中肝素酶处理结果提示HSPGs也参与NAc-PFFs的结合，可能涉及多种受体机制。研究还讨论了乙酰化对α-syn聚集性质的争议性，以及不同PFF制备方法和神经元模型可能导致结果差异。体内结果表明，NAc-PFFs注射后病理扩散减慢，表现为生存期延长和关键脑区pSyn减少，可能归因于其较低的结合、内化和播种能力。研究结论（翻译）：“总之，翻译后修饰可显著影响蛋白质的结构、生化和生理特性。虽然α-syn的翻译后修饰已被充分描述，但其许多生理和病理功能仍有待阐明。这些特性和机制至今尚未被充分利用于靶向治疗的设计。在本工作中，研究人员首次证明，由N端乙酰化α-syn生成的预形成纤维在体外和体内均表现出根本性改变的细胞表面结合特性，以及减少的内化、播种和细胞间传播。因此，更广泛地看，本研究指出N端乙酰化的失衡或失调可能影响α-syn病理或突触核蛋白病（如PD）的疾病进展速率。”