《Plant Diversity》：Chromosome-scale genome assembly of Atractylodes lancea reveals AlTPS37, a sesquiterpene synthase associated with chemotype-specific eudesmol biosynthesis
编辑推荐：
摘要：茅苍术(Atractylodes lancea，菊科)是常用的重要中药材，其主要活性成分为倍半萜类化合物，但其化学型间倍半萜组分差异的分子机制尚不清楚。研究人员采用顶空-气相色谱/质谱(HS?GC/MS)及气相色谱?质谱(GC?MS)定量发现，茅苍术可划
摘要：茅苍术(Atractylodes lancea，菊科)是常用的重要中药材，其主要活性成分为倍半萜类化合物，但其化学型间倍半萜组分差异的分子机制尚不清楚。研究人员采用顶空-气相色谱/质谱(HS?GC/MS)及气相色谱?质谱(GC?MS)定量发现，茅苍术可划分为两个化学型——茵陈醇型(hinesol chemotype, HO?型，以大别山区为代表)显著富集hinesol、guaiol及三种桉叶醇异构体(α?、γ?、β?eudesmol)；苍术酮型(atractylon chemotype, AT?型，以茅山地区为代表)则富集atractylon、β?elemene和β?caryophyllene。研究人员对HO?型茅苍术进行了染色体级基因组组装(基因组大小4.43 Gb，contig N50=101.66 Mb)，从中鉴定到74个萜类合酶(terpene synthase, TPS)基因，筛选其中9个进行功能验证。酶学实验表明AlTPS37、AlTPS70和AlTPS71参与HO?型富集倍半萜的生物合成：AlTPS37主要催化生成γ?、α?和β?eudesmol；AlTPS70和AlTPS71分别参与guaiol?及bulnesol?相关倍半萜的生成。对HO?型和AT?型中AlTPS37单倍型进行比较并结合定点突变分析发现，等位基因功能分化及HO?型中AlTPS37较高表达水平共同导致两化学型间桉叶醇积累模式的差异。上述结果表明AlTPS37是与化学型特异性桉叶醇积累相关的重要TPS基因，为理解茅苍术化学型相关倍半萜分化提供了新视角。
论文解读：《茅苍术(Atractylodes lancea)染色体级基因组组装揭示与化学型特异性桉叶醇生物合成相关的倍半萜合酶AlTPS37》
茅苍术(Atractylodes lancea (Thunb.) DC.)为菊科多年生药用植物，以根茎入药，其挥发性倍半萜类化合物(如atractylon、hinesol、eudesmol等)是主要药效物质基础。同种茅苍术居群因产地不同存在明显的次生代谢物组成差异，据此划分为以安徽、湖北大别山区为代表的茵陈醇型(hinesol chemotype, HO?型，特征成分为hinesol及α?/γ?/β?eudesmol)和以江苏茅山为代表的苍术酮型(atractylon chemotype, AT?型，特征成分为atractylon及atractylodin相关成分)。既往研究较多关注AT?型中atractylon生物合成途径及相关TPS(terpene synthase, 萜类合酶)基因，而HO?型中桉叶醇(eudesmol)异构体的生物合成TPS基因长期未被鉴定，HO?型与AT?型倍半萜分化的遗传与酶学机制尚不明确。为此，Zha Liangping、Liang Hua等研究人员以安徽岳西HO?型及江苏AT?型茅苍术为材料，开展染色体级基因组测序、代谢组学、转录组学、TPS基因家族分析及酵母异源表达与定点突变实验，旨在阐明HO?型富集桉叶醇的生物合成关键基因及其在化学型分化中的作用。该研究成果发表于《Plant Diversity》。
主要关键技术方法
研究人员采集安徽岳西(HO?YX)、湖北英山(HO?YS)HO?型及江苏句容茅山AT?型茅苍术根茎为样本队列。采用PacBio HiFi长读长测序联合Hi?C(chromatin conformation capture combined with high?throughput sequencing，染色质构象捕获高通量测序)技术进行染色体级基因组组装；通过k?mer分析估算基因组大小；采用同源注释、RNA?seq及ab initio预测进行基因注释；利用HS?GC/MS和GC?MS进行挥发性有机物(volatile organic compounds, VOCs)定性定量分析；通过转录组(RNA?seq)筛选差异表达基因；以Pfam结构域筛选TPS基因家族并进行系统进化与基因复制模式分析；将候选AlTPS基因克隆至酵母表达载体转化BY?T15酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)感官细胞进行体外酶活检测，以GC?MS鉴定产物；分别克隆HO?型和AT?型中AlTPS37单倍型并构建定点突变体(AlTPS37?AD349E、AlTPS37?AI372N、AlTPS37?BE349D、AlTPS37?BN372I)验证关键氨基酸位点功能；启动子顺式元件分析及候选转录因子(transcription factor, TF)与AlTPS37表达相关性分析采用RT?qPCR验证。
研究结果
3.1. Metabolomic and volatile organic profiles in two A. lancea chemotypes(两个茅苍术化学型代谢组及挥发性成分类比)
研究人员通过HS?GC/MS和GC?MS检测HO?YX、HO?YS及AT?型根茎VOCs，检出916种代谢物，其中倍半萜类占17.58%。正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS?DA)及主成分分析(principal component analysis, PCA)显示两化学型明显分离。定量证实HO?型显著高含hinesol、γ?/α?/β?eudesmol及guaiol，AT?型显著高含atractylon、β?elemene和β?caryophyllene，确认了化学型标志性代谢物差异。
3.2. Genome sequencing, assembly, and annotation(基因组测序、组装与注释)
流式细胞术估算茅苍术基因组约4.43 Gb；PacBio HiFi+Hi?C混合组装获得染色体级基因组(contig N50=101.66 Mb，12条假染色体锚定率97.58%)，BUSCO完整性99.20%。预测蛋白编码基因60,950个，重复序列占56.83%(主要为Copia和Gypsy型LTR?RT)，注释质量优于此前已发表组装。
3.3. Genome evolution and comparative genomic analysis of A. lancea(茅苍术基因组进化及比较基因组分析)
系统发生分析显示茅苍术与牛蒡(Arctium lappa)及洋蓟(Cynara cardunculus)亲缘最近，分化时间约27.7百万年前(Mya)。茅苍术特有基因家族3,486个，GO与KEGG富集显示倍半萜和三萜生物合成(ko00909)等相关通路显著富集，提示与其丰富挥发性倍半萜相适应。
3.4. Whole?genome duplication event(全基因组复制事件)
Ks同义替换分析显示茅苍术具双峰(Ks=1.84古老真双子叶植物共享WGD?γ事件及Ks≈0.10近期大片段复制)，染色体内共线性提示近期可能发生过一次物种特异性全基因组复制(whole?genome duplication, WGD)，并与菊科植物进化相符。
3.5. Gene duplication and transcription profile of genes involved in terpenoid biosynthesis(萜类生物合成途径基因复制与转录谱)
上游MVA途径基因家族扩张(尤HMGR含7个成员)，WGD主要促MVA途径扩展。转录组显示HO?型中MVA途径关键基因(AACT1、HMGR1/4/7等)及FPP1显著上调，与HO?型倍半萜前体供给增强相吻合。
3.6. Phylogenetic analysis and duplication patterns of the TPS family in A. lancea(茅苍术TPS家族系统进化与复制模式)
从HO?型基因组鉴定74个完整结构域AlTPS基因，主要经邻近复制(proximal duplication, PD)和串联复制(tandem duplication, TD)扩增，TPS?a亚族集中于Chr01和Chr05，其中Chr05存在一个含15个TPS基因的萜类生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster, BGC)。表达过滤结合进化聚类选出候选HO?型高表达TPS基因。
3.7. Genomic and functional analyses identify candidate TPS genes associated with chemotype?specific sesquiterpenoid divergence in A. lancea(基因组与功能分析鉴定与化学型特异性倍半萜分化相关的候选TPS基因)
整合差异表达与代谢?基因相关性，锁定AlTPS6、AlTPS36、AlTPS37、AlTPS70、AlTPS71(HO?型高表达)及AlTPS32(AT?型高表达)为化学型分化关键候选TPS。酵母异源表达显示AlTPS37、AlTPS70、AlTPS71具催化活性，其余无活性。
3.8. Functional characterization identifies AlTPS37 as an important eudesmol synthase associated with HO?type?enriched sesquiterpenoid biosynthesis in A. lancea(功能表征确定AlTPS37为与HO?型富集倍半萜生物合成相关的重要桉叶醇合酶)
AlTPS37主要催化生成γ?eudesmol(占总产物68.06%)、α?eudesmol(17.13%)和β?eudesmol(8.82%)，微量bulnesol和guaiol；AlTPS70主产bulnesol，AlTPS71产少量γ?eudesmol、guaiol和bulnesol。亚细胞定位显示三者定位于细胞核和细胞质，分子对接提示底物farnesyl diphosphate(FPP)结合模式差异导致催化特异性不同。确认AlTPS37为茅苍术中首要eudesmol合酶。
3.9. Allelic variation of AlTPS37 affects eudesmol accumulation in the HO and AT chemotypes of A. lancea(AlTPS37等位变异影响HO与AT化学型桉叶醇积累)
从HO?型克隆得到主要单倍型AlTPS37?A(第349位Asp/D，第372位Ile/I)，AT?型主要为AlTPS37?B。酶活显示AlTPS37?A催化三种eudesmol产量分别为AlTPS37?B的14.04、21.18和34.32倍。定点突变证实第372位Ile(I)→Asn(N)使AlTPS37?A活性大幅下降，反向突变使AlTPS37?B活性显著上升，而第349位影响较小。同时HO?型中AlTPS37转录水平显著高于AT?型，启动子预测含MYC/MYB/G?box元件，AlbHLH及AlMYB与AlTPS37表达及eudesmol含量呈显著正相关，提示受转录调控。综上，等位功能分化与表达差异共同导致化学型间桉叶醇积累差异。
讨论与结论
研究人员首次完成茅苍术HO?型染色体级高质量基因组组装并系统解析TPS基因家族，鉴定并验证了AlTPS37为茅苍术主要桉叶醇(eudesmol)合酶——AlTPS37?A单倍型(主要存在于HO?型)催化效率远高于AlTPS37?B(主要存在于AT?型)，关键催化位点第372位Ile/Asn置换是功能分化的决定因素，加之HO?型中AlTPS37更高转录水平，二者协同造成HO?型桉叶醇显著富集。此外AlTPS70和AlTPS71参与HO?型其他倍半萜(guaiol、bulnesol)合成。本研究填补了茅苍术HO?型特征倍半萜——桉叶醇生物合成关键酶基因的空白，从基因组演化、TPS基因扩增、等位变异及转录调控多层次阐明了化学型间倍半萜分化的分子机制，为茅苍术优良种质选育及品质评价提供了分子靶点。
