《Plant Physiology and Biochemistry》：ClWRKY75 regulates lignin biosynthesis to confer Colletotrichum fructicola resistance in watermelon
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西瓜是重要的园艺作物，在整个生长周期中受到多种真菌病害威胁，其中胶孢炭疽菌是炭疽菌属（Colletotrichum spp.）成员之一，因可侵染幼苗和果实并引发炭疽病而尤为严重。炭疽病防控主要依赖杀菌剂，而抗病西瓜育种则受限于抗性基因匮乏及其分子机制不明确。研
西瓜是重要的园艺作物，在整个生长周期中受到多种真菌病害威胁，其中胶孢炭疽菌是炭疽菌属（Colletotrichum spp.）成员之一，因可侵染幼苗和果实并引发炭疽病而尤为严重。炭疽病防控主要依赖杀菌剂，而抗病西瓜育种则受限于抗性基因匮乏及其分子机制不明确。研究人员在此表明，通过比较转录组分析发现，WRKY转录因子ClWRKY75在抗病材料M10受到胶孢炭疽菌侵染后被显著诱导。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）抑制ClWRKY75后，抗病M10植株转变为感病表型，并伴随木质素积累下降。进一步研究表明，ClWRKY75可直接结合并激活木质素生物合成途径关键基因ClPAL20的启动子。这些结果揭示，ClWRKY75通过促进木质素合成增强炭疽病抗性，并为抗病西瓜育种提供了有价值的基因资源。
该论文发表于《Plant Physiology and Biochemistry》，围绕西瓜对新近报道病原胶孢炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的抗性分子机制展开，核心聚焦于WRKY转录因子ClWRKY75对木质素生物合成及病害抗性的调控作用。研究背景在于，西瓜炭疽病会显著危害叶片、茎和果实，影响产量与品质，而当前生产上仍主要依赖化学杀菌剂进行防治，长期使用存在食品安全和生态环境风险。与此同时，西瓜抗病育种进展受限于抗性基因资源不足以及抗病分子网络尚不清晰。已有研究表明，苯丙烷代谢途径（phenylpropanoid pathway）及其下游木质素沉积在植物抵御病原入侵过程中具有重要意义，既可增强细胞壁机械强度，也可提升植物对病原分泌细胞壁降解酶的耐受性。然而，在西瓜中，尤其是针对胶孢炭疽菌的抗性调控机制仍缺乏系统研究，因此开展该研究具有明确的理论价值与育种应用意义。
研究人员首先比较了抗病自交系“M10”和感病自交系“HX6”在胶孢炭疽菌侵染后的表型、生理和转录组差异，随后结合病毒诱导的基因沉默（VIGS）、qRT-PCR、组织化学染色、木质素含量测定、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告（dual-luciferase assay）和凝胶迁移率变动分析（EMSA）等手段，对候选转录因子ClWRKY75及其下游靶基因进行功能验证。研究得出的结论是：ClWRKY75是西瓜抗胶孢炭疽菌的重要正调控因子，其可直接激活ClPAL20等木质素生物合成相关基因表达，促进叶片木质素沉积，从而强化细胞壁防御并提高植株抗病性。这一发现构建了西瓜炭疽病抗性中“转录因子—木质素合成—细胞壁防御”的分子框架，为抗病分子育种提供了候选基因资源。
研究采用的关键技术方法主要包括：以西瓜抗病自交系“M10”和感病自交系“HX6”为材料，在幼苗两叶期喷施1×10
6 conidia/mL胶孢炭疽菌分生孢子悬浮液进行接种；通过RNA测序（RNA-seq）对0、3、4 dpi叶片样本开展比较转录组分析，筛选差异表达基因（DEGs）；通过qRT-PCR验证关键基因表达；采用VIGS对ClWRKY75、ClPAL20和ClCCoAOMT1进行沉默以评估抗病表型与木质素变化；结合石蜡切片染色与生化测定分析木质素积累；通过亚细胞定位明确ClWRKY75定位；并使用Y1H、EMSA和双荧光素酶实验验证ClWRKY75与ClPAL20启动子的直接结合及转录激活关系。
在研究结果部分，论文首先以“3.1. Phenotypic, physiological and metabolic differences between resistant and susceptible watermelon lines in response to C. fructicola infection”为题，比较了抗病与感病材料对病原侵染的整体响应。研究显示，M10表现出明显抗病性，而HX6高度感病。台盼蓝染色进一步表明，M10在3 dpi时病原扩展受限，而HX6出现广泛坏死。生理指标分析表明，5 dpi时M10中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性显著升高，丙二醛（MDA）含量维持较低水平；相对地，HX6抗氧化能力较弱且MDA积累较高，提示氧化损伤更严重。组织学染色和定量分析还表明，接种前两材料木质素水平相近，但接种后M10的木质素显著积累。该部分结果说明，较强的抗氧化应答和病原诱导的木质素生物合成共同构成了M10抗炭疽病的重要基础。
在“3.2. Differential expression analysis reveals key genes responsive to C. fructicola infection”部分，研究人员利用18个文库开展RNA-seq分析，系统筛选对胶孢炭疽菌响应的关键基因。主成分分析（PCA）显示，未接种时M10与HX6转录组模式高度相近，而接种后3 dpi两种基因型均发生大规模转录重编程。差异表达分析显示，M10中检测到11,311个差异表达基因，HX6中检测到7,751个。共有的6,341个差异表达基因被划分为6个表达簇，其中1,015个在感染后M10中显著上调，并富集于植物—病原互作、转录因子调控和苯丙烷生物合成等通路。该结果为后续从转录因子和木质素合成途径中挖掘抗病关键调控因子奠定了基础。
在“3.3. Lignin biosynthesis genes involved in resistance of watermelon to C. fructicola”部分，研究进一步聚焦苯丙烷生物合成途径中的木质素合成相关基因。结果显示，ClPALs、Cl4CLs、ClCCR、ClCCoAOMT和ClPODs等多个基因在M10接种后上调。qRT-PCR验证证实，ClPAL20、ClPAL30、ClPAL50和ClCCR1在接种后M10中的表达显著高于HX6。功能验证中，研究人员分别沉默ClPAL20和ClCCoAOMT1，结果两类沉默植株均表现出对胶孢炭疽菌更高的感病性，同时木质素含量显著下降。由此可见，苯丙烷途径中的木质素合成基因确实参与西瓜对胶孢炭疽菌的抗性形成，其作用与促进木质素积累密切相关。
在“3.4. ClWRKY75 positively regulates the resistance of watermelon to C. fructicola”部分，研究人员从富集到的转录因子中锁定了WRKY家族成员Cla97C05g095150，即ClWRKY75。该基因在M10的3 dpi时被强烈诱导，系统发育分析显示其与已知免疫相关的AtWRKY75聚为一类，提示其可能参与植物免疫调控。WRKY家族整体表达谱分析进一步显示，ClWRKY75在M10中呈现特异而显著的诱导模式。时间序列qRT-PCR结果表明，ClWRKY75在M10中自2至5 dpi持续显著升高，而在HX6中基本维持基础表达。重测序分析未在M10与HX6之间发现ClWRKY75的高可信度SNP或Indel，说明其差异表达并非由序列变异导致。亚细胞定位结果显示，ClWRKY75蛋白主要定位于细胞核，符合转录因子的功能特征。进一步通过VIGS沉默ClWRKY75后，M10植株抗性明显下降，木质素含量减少，同时SOD、POD和CAT活性降低而MDA升高。该部分结果明确证明，ClWRKY75是西瓜抗胶孢炭疽菌的正调控因子，并且很可能通过调节木质素合成和抗氧化防御参与病害应答。
在“3.5. ClWRKY75 physically binds to and activates ClPAL20”部分，研究进一步解析ClWRKY75的分子作用机制。研究人员首先检测ClWRKY75沉默植株中关键木质素合成基因的表达，发现ClPAL10、ClPAL20、ClPAL30、ClPAL50和ClCCoAOMT1等多个基因表达下调，说明ClWRKY75对这些基因的转录激活具有必要性。随后，研究人员分析ClPAL20启动子，发现其中含有WRKY蛋白特异识别的W-box顺式作用元件。Y1H实验表明，ClWRKY75能够与ClPAL20启动子发生互作；EMSA进一步证明ClWRKY75可特异结合ClPAL20启动子中的W-box元件；双荧光素酶实验则显示，ClWRKY75可显著增强ClPAL20启动子的转录活性。研究同时观察到ClPAL10、ClPAL30、ClCCR1和ClCCoAOMT1启动子中也存在W-box元件，双荧光素酶检测提示ClWRKY75对这些启动子同样具有激活作用。综合而言，该部分建立了ClWRKY75位于ClPAL20上游并直接调控其表达的证据链，表明ClPAL20是ClWRKY75介导抗病网络中的关键下游因子。
讨论部分围绕病害防控需求、木质素防御作用及WRKY转录调控网络展开。论文指出，胶孢炭疽菌作为我国部分地区新鉴定的西瓜炭疽病病原，对西瓜生产构成现实威胁，而抗病育种是比长期依赖化学防治更可持续的策略。研究通过整合表型、生理和转录组数据，证明M10抗性与苯丙烷生物合成途径和转录因子调控通路显著激活密切相关。木质素作为细胞壁主要组分，在病原侵染后增加沉积，可增强组织机械屏障，限制病原扩展；本研究中ClPAL20和ClCCoAOMT1的功能验证进一步支撑了这一点。与此同时，ClWRKY75被鉴定为连接病原诱导信号与木质素合成响应的关键调节节点。论文也指出，虽然M10与HX6之间ClWRKY75编码区和启动子区未发现高可信度序列变异，但其诱导表达存在明显差异，因此其上游调控机制仍值得进一步研究。整体上，讨论部分强调了ClWRKY75在西瓜炭疽病抗性中的核心作用，并将其置于更广泛的植物WRKY介导抗病调控框架中加以理解。
研究结论部分可译为：本研究通过基于转录组的筛选和功能验证，鉴定出ClWRKY75是西瓜炭疽病抗性的关键调控因子。基因沉默分析表明，ClWRKY75通过直接激活苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia-lyase）途径中的关键基因ClPAL20，正向调控西瓜对胶孢炭疽菌的防御反应。这种激活增强了叶片中的木质素生物合成与沉积，从而强化细胞壁结构并限制病原入侵。总体而言，该研究建立了ClWRKY75介导的转录调控与基于木质素的防御之间的分子联系框架，并为培育抗炭疽病西瓜品种提供了有价值的遗传资源。
