葡萄(Vitis vinifera)糖转运蛋白VvHT5过表达驱动宿主–灰霉菌(Botrytis cinerea)协同转录重编程并促进病原菌定殖

《Plant Physiology and Biochemistry》：Overexpression of the sugar transporter VvHT5 in grapevine drives coordinated host–pathogen transcriptional reprogramming favoring Botrytis cinerea

　　

摘要：糖是植物–病原互作的关键调节因子，既作为代谢资源又作为信号分子影响防卫结局。在葡萄(Vitis vinifera L.)中，六碳糖转运蛋白VvHT5是拟南芥(Arabidopsis thaliana)STP13的直系同源物，在真菌侵染时被强烈诱导，暗示其在病原相关糖分配中的作用。本研究探讨了VvHT5在葡萄对坏死营养型真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)感病性中的功能。研究人员在两个栽培品种Thompson Seedless和Chardonnay中获得了VvHT5过表达转基因株系，其叶片显示己糖摄取增强。接种B. cinerea后，这些株系表现出病斑扩展加剧和真菌增殖增加，这与此前在表达VvHT5的拟南芥中观察到的耐受表型相反。双RNA测序(dual RNAseq)分析显示，VvHT5过表达引发有利于碳水化合物代谢、细胞壁重塑及防卫反应减弱的转录景观，同时伴随真菌参与糖获取和毒力相关基因的上调。结果表明，虽然VvHT5在拟南芥中有助于限制病原菌可利用糖量，但在葡萄中组成型激活反而提高宿主对B. cinerea的适宜性。研究发现凸显了糖介导互作的复杂性，并强调宿主背景在决定植物与病原争夺碳源资源结局中的重要性。

论文解读——《Plant Physiology and Biochemistry》发表成果：葡萄VvHT5过表达对葡萄–灰霉菌互作中糖转运与协同转录重编程的影响

研究背景与立项依据

糖不仅是植物的能量与结构物质，也作为信号分子参与植物免疫调控，并在植物与病原真菌争夺碳源的"军备竞赛"中发挥核心作用。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中STP13编码质膜定位的H⁺/己糖同向转运蛋白(hexose transporter/Sugar Transport Protein, STP)，受灰霉菌(Botrytis cinerea)及病原相关分子模式(PAMPs)强烈诱导；AtSTP13过表达可把质外体己糖导入胞内从而降低坏死营养型病原可利用糖、增强抗性，而atstp13突变体感病性升高。VvHT5是葡萄中AtSTP13的直系同源基因(STP13-like hexose transporter)，在感染白粉菌(Erysiphe necator)、霜霉病菌(Plasmopara viticola)、枯死病菌(Eutypa lata)及B. cinerea时均被显著诱导，并与细胞壁转化酶(cell wall invertase, cwINV)及SWEET家族转运蛋白协同调控质外体糖流。然而VvHT5在原生宿主葡萄中组成型过表达对B. cinerea–葡萄互作的具体功能及宿主–病原双向转录影响尚未阐明。由于模式植物拟南芥中STP13-like的功能结论未必适用于作物特异性生理背景，本研究通过在葡萄中创制VvHT5过表达株系并结合病害表型鉴定与宿主–病原双RNA测序(dual RNAseq)，旨在明确VvHT5在葡萄–B. cinerea互作中是抗性因子还是感病因子，并解析其引发的宿主与病原菌协同转录重编程。

主要关键技术方法

研究人员以欧洲葡萄(Vitis vinifera)栽培品种Thompson Seedless(TS)和Chardonnay(Cha)未成熟子房诱导胚性愈伤，经农氏根瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101介导遗传转化pK7WGF2-35S::GFP–VvHT5融合构建体，获得稳定过表达株系；以野生型(WT)为对照。通过qRT-PCR(内参VvGAPDH)、Western blot(抗GFP及抗VvHT5抗体)、荧光显微镜及共聚焦显微镜确认转录与蛋白积累及质膜定位。采用[¹⁴C]-D-葡萄糖摄取实验(±质子载体CCCP)测定叶片圆盘主动己糖转运活性，并用Megazyme试剂盒定量可溶性糖(蔗糖/葡萄糖/果糖)。B. cinerea B05.10分生孢子悬液接种叶圆盘(6 μL, 5×10⁵conidia·mL^-?11/4 PDB)或全叶喷雾，72 hpi以叶绿素荧光成像及ImageJ量化坏死面积，qPCR(VvPDS/BcCUTA)定量真菌生物量。取TS WT与高表达株TS#14未处理(NT)、模拟接种(Mock)及B. cinerea感染(48 hpi)样品进行链特异性polyA文库Illumina NovaSeq 6000双端测序，读段比对至葡萄PN40024 T2T基因组与B. cinerea B05.10基因组串联文件，FeatureCounts定量，edgeR进行差异表达分析(DEG: |log₂FC|≥1, BH-adjusted p<0.05)，topGO做基因本体(Gene Ontology, GO)富集。

研究结果

3.1. Generation of VvHT5-overexpressing grapevine lines through genetic transformation

将CaMV 35S启动子驱动之GFP–VvHT5融合基因通过农杆菌介导法转化TS与Cha胚性组织，经卡那霉素筛选获得38株TS与23株Cha抗性植株，最终分别获得2个TS(TS#14、TS#21)与6个Cha(Cha#11、#12、#14、#19、#20、#21)稳定过表达株系及其对应WT对照，温室生长形态无显著差异。

3.2. Characterization of transgenic lines

qRT-PCR证实所有转基因株系VvHT5总转录本显著上调(最高TS#14约130倍)，GFP引物特异地检出转基因转录本。Western blot检出相应VvHT5蛋白积累(除TS#21可能因转录后调控未检出蛋白)。宽场与共聚焦荧光显微镜显示GFP–VvHT5定位于质膜，且在强表达株(TS#14、Cha#14、Cha#21)维管束信号最强。[¹⁴C]-葡萄糖摄取实验表明过表达株叶圆盘主动己糖摄取显著升高(TS#14增加76%，Cha株系最高34%)，且可被质子载体CCCP抑制；可溶性糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)胞内含量与WT无差异，说明VvHT5过表达增强质膜H⁺/己糖同向转运通量但不改变稳态糖池大小。

3.3. Overexpression of VvHT5 enhances grapevine susceptibility to B. cinerea

离体叶圆盘接种B. cinerea后，TS#14与Cha过表达株系坏死面积显著大于各自WT(p<0.05)，大斑比例升高、中小斑减少；qPCR显示感染组织中B. cinerea生物量在TS#14高于WT。此感病增强表型在两个不同基础抗性的栽培品种中均可重现，与拟南芥中VvHT5或AtSTP13过表达增强抗B. cinerea的结果相反，说明宿主背景决定STP13-like功能——在葡萄中组成型VvHT5过表达促进而非限制B. cinerea发展。

3.4. Global transcriptional landscape

Dual RNAseq比对显示感染TS#14样本中B. cinerea读段占比更高，与更高真菌生物量相符。主成分分析(PCA)表明未处理与模拟接种样本基因型间无分离，但B. cinerea感染后TS WT与TS#14宿主转录谱明显分开；真菌在两种宿主背景下转录程序亦显著不同，表明VvHT5过表达重塑了宿主与病原菌双方感染期转录组。

3.5. Overexpression of VvHT5 has negligible constitutive effects

未处理条件下TS#14 vs TS WT仅检出11个差异表达基因(含VvHT5本身及少量UDP-糖基转移酶UGT、细胞壁木葡聚糖内转糖苷酶XTH等)，无典型防御通路基因组成型变化，说明VvHT5过表达基础转录干扰极小，感染期差异源于病原诱导的宿主背景依赖响应。

3.6. Differential transcriptional responses of grapevine genotypes during infection

B. cinerea感染对比Mock，TS WT与TS#14分别有9096与9589个DEGs，大量重叠共有DEGs，VvHT5本身在48 hpi两基因型中表达水平相近。基因型特异DEGs的GO富集显示：TS WT特异上调包括茉莉酸(jasmonic acid, JA)与乙烯(ethylene)激素信号、脂质与硫代谢、自噬(autophagy, 如ATG18/ATG7)、角质(cutin)与细胞壁强化、植保素(如phylloquinone)合成及染色质/小RNA调控，符合抗坏死营养型真菌的多层次防卫激活。TS#14特异响应则JA与水杨酸(salicylic acid, SA)共激活(潜在拮抗致防御削弱)，细胞壁木质化/加固受抑，病程相关转录沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)相关条目异常，碳转运(磷酸烯醇式丙酮酸triose-P、钙信号)与部分己糖转运改变，整体呈防御失调及利于病原定殖的代谢偏向。

3.7. Transcriptional reprogramming of B. cinerea in response to VvHT5 overexpression

B. cinerea在TS#14 vs TS WT宿主上共有286个DEGs，其中265个在TS#14中上调。TS WT宿主上菌方富集铁/铜离子转运、细胞壁重构及毒素合成(适应胁迫)；TS#14宿主上菌方显著富集植物细胞壁半纤维素(木聚糖xylan、甘露聚糖mannan、阿拉伯聚糖arabinan)降解相关碳水化合物活性酶(CAZymes)、己糖及戊糖转运体、脂质代谢及腐胺(putrescine)代谢，表明病原菌感知到更有利的碳源环境从而激活营养获取程序。

3.8. Sugar transporters and cell wall invertases in Vitis and B. cinerea during infection

葡萄中VvHT5与细胞壁转化酶cwINV1/cwINV5及己糖外排转运蛋白VvSWEET4协同感染诱导，其他STP/ERD6-like及TMT3等在感染中下调或不变，且各糖转运蛋白基因表达量在TS WT与TS#14间无显著差异，提示差异不在稳态mRNA水平而在转运通量与翻译后调控。B. cinerea中多个己糖转运基因(BcHxT8/10/12/13/15/17/19等)在TS#14感染时偏好性高表达，另一些(BcFRT1、Bchex系列、部分BcHxT)在TS WT感染时高表达，反映真菌根据宿主糖动态切换不同己糖转运蛋白亚家族以适配微环境。

讨论与结论总结

本研究首次在作物原生宿主(葡萄)中证明STP13-like己糖转运蛋白VvHT5组成型过表达并非如拟南芥模型所预测的抗性因子，而是通过改变质外体→胞内己糖通量(不改变总糖池)引起宿主防卫程序失调(JA/SA失衡、细胞壁强化减弱)并促使B. cinerea上调CAZymes与糖转运基因，协同促进病原菌碳获取与毒力表达，最终增强感病性。这说明STP13-like转运蛋白在植物–病原互作中的功能是宿主背景与病原营养生活方式依赖的：在拟南芥中AtSTP13/VvHT5可限制坏死营养型病原可利用己糖而增效抗性；在葡萄中对坏死营养型B. cinerea却因宿主生理与防御网络差异被病原"利用"成为感病因子。研究确立了糖转运驱动的碳流重编程是植物–坏死营养型真菌互作中决定抗/感平衡的关键节点，强调了用模式植物推论作物时应谨慎，并为以糖转运及宿主–病原碳竞争为靶标的葡萄抗病改良提供了理论依据。