XsMAX2负调控文冠果(Xanthoceras sorbifolium)受精后胚珠发育

《Plant Physiology and Biochemistry》：XsMAX2 negatively regulates post-fertilization ovule development in Xanthoceras sorbifolium

　　

拟南芥(Arabidopsis thaliana)MAX2基因编码含富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域的F-box蛋白，在调控植物发育与胁迫响应中起关键作用。尽管MAX2在上述过程中的功能已被广泛表征，其在受精后胚珠发育中的具体作用仍不清楚。研究人员前期工作鉴定到文冠果(Xanthoceras sorbifolium)中MAX2同源基因XsMAX2在受精卵珠中高表达。本研究表明XsMAX2为定位于细胞核的蛋白，可与SCF(SKP1-CUL1-F-box)泛素连接酶复合体核心组分SKP1互作。生长素(auxin)响应转录因子ARF2直接结合XsMAX2启动子，调控其在受精卵珠中的表达。功能研究显示XsMAX2上调导致果实及胚珠败育增加，而其下调促进胚珠生长发育。值得注意的是，XsMAX2表达受营养可用性（如磷酸盐和糖类）及植物激素途径（如独脚金内酯strigolactone和脱落酸abscisic acid, ABA）精确调控。机制上，XsMAX2可能通过抑制细胞周期相关基因并诱导受精后胚珠中异常程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，从而损害早期种子发育。综上，本研究确立XsMAX2为文冠果受精后胚珠发育的关键负调控因子，整合环境及内源信号以控制生殖成功。

本研究发表于《Plant Physiology and Biochemistry》，针对文冠果（Xanthoceras sorbifolium）受精后胚珠高比例败育导致产量低下的生产问题展开。拟南芥MAX2同源基因在胚后种子发育中的功能尚不明确，而文冠果作为重要的木本油料树种，其受精后胚珠败育分子机制研究几近空白。研究人员以文冠果XsMAX2（MAX2同源基因）为对象，探究其在受精后胚珠发育中的调控作用及受营养—激素信号调节的机制，旨在阐明其负调控胚珠发育的分子机理，为改良文冠果坐果率提供理论依据。

研究人员以8年生文冠果人工授粉后正常发育与异常发育（败育）胚珠为材料，采用亚细胞定位、酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)及双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)验证蛋白互作，酵母单杂交(yeast one-hybrid, Y1H)验证转录因子与启动子结合，病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)进行功能验证，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因表达，液相色谱—串联质谱(LC-MS/MS)测定ABA含量，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)检测PCD，结合田间磷肥及离体蔗糖、ABA、GR24（独脚金内酯类似物）处理分析营养与激素对XsMAX2表达的调控及胚珠发育表型。

3.1. XsMAX2 is located in the nucleus and interacts with XsSKP1

XsMAX2蛋白N端含F-box结构域，C端含3个LRR结构域。融合GFP瞬时表达显示XsMAX2定位于细胞核；Y2H与BiFC证实XsMAX2与XsSKP1（SKP1同源蛋白）在核内发生物理互作，表明XsMAX2为功能性F-box蛋白，可组装入SCF^MAX2泛素连接酶复合体。

3.2. XsARF2 regulates expression of XsMAX2 in fertilized ovules by directly binding to its promoter

Y1H筛库获得结合XsMAX2启动子的生长素响应因子XsARF2（ARF2同源蛋白），启动子区含AuxRE元件(TGTCTC)。Y1H验证XsARF2直接结合XsMAX2启动子；qRT-PCR显示XsARF2与XsMAX2在败育胚珠中均显著上调，表明XsARF2直接激活XsMAX2转录。

3.3. XsMAX2 is involved in regulation of post-fertilization ovule development in response to phosphate availability

受精后4天XsMAX2在正常发育胚珠中表达下降，而在败育胚珠中随发育持续上调。施磷（P₂O₅）显著下调XsMAX2并降低胚珠败育率、提高坐果率；缺磷条件下XsMAX2上调且胚珠败育加剧，说明XsMAX2介导缺磷诱导的受精后胚珠发育抑制。

3.4. Tobacco rattle virus (TRV)-mediated XsMAX2 gene silencing promotes post-fertilization ovule development

VIGS沉默XsMAX2后受精卵珠中XsMAX2转录水平显著降低，胚珠内正常胚乳发育比例升高（31%），坐果率提升，证明XsMAX2下调可促进受精后胚珠与果实发育。

3.5. Exogenous sugar supply may alleviate XsMAX2-mediated inhibition of ovule development after fertilization

卵巢腔注射蔗糖溶液使胚囊面积增大、正常发育比例升高，并剂量依赖性下调XsMAX2表达；渗透对照（甘露醇）无此效应，表明糖供应抑制XsMAX2表达从而缓解其对胚珠发育的抑制。

3.6. XsMAX2 expression was induced by ABA in fertilized ovules

败育胚珠内源ABA约为正常胚珠4倍；外源ABA处理剂量依赖性地诱导XsMAX2上调并最终引致胚珠败育，提示高ABA可通过上调XsMAX2参与胁迫下胚珠败育。

3.7. XsMAX2 modulates cell cycle-related gene expression to regulate ovule development following fertilization

GR24（独脚金内酯类似物）处理上调XsMAX2并下调细胞周期基因XsCYCD3;2、XsCYCD6;1、XsCDKB1;2；XsMAX2沉默则使上述细胞周期基因上调。说明XsMAX2可能作为细胞周期进展基因的转录抑制因子参与早期种子细胞增殖调控。

3.8. XsMAX2 may contribute to an aberrant programmed cell death (PCD) pathway in fertilized ovules

TUNEL显示正常发育胚珠PCD发生于珠心近胚乳区、合点珠心及珠被；高XsMAX2败育胚珠中珠心近胚乳区PCD减弱但合点珠心与游离胚乳中存在广泛PCD信号。qRT-PCR显示败育胚珠中半胱氨酸蛋白酶基因XsCYS1、XsCYS2及天冬氨酸蛋白酶基因XsASP表达显著升高，暗示XsMAX2可能触发异常PCD致胚珠败育。

讨论部分总结

研究人员提出XsMAX2受营养（磷酸盐、糖）与激素（独脚金内酯、ABA、生长素通过XsARF2）共同调控，在营养充足时低表达以促进胚珠发育，在缺磷/低糖/高ABA/高独脚金内酯条件下高表达，通过抑制细胞周期基因（CYCD、CDKB）及异常激活PCD相关蛋白酶基因（CYS、ASP），引起胚乳发育停滞与异常PCD，最终导致受精后胚珠败育。该调控网络体现了文冠果通过XsMAX2整合环境与内源信号调节库强度（sink strength）以适应养分限制的生殖适应策略。ABA与独脚金内酯信号存在互作，乙烯亦参与文冠果胚珠败育，多重激素途径共同精细调控胚珠命运。

结论（翻译）

本研究表明XsMAX2通过调控营养响应途径及细胞周期进程负调控文冠果受精后胚珠发育。缺磷与糖受限条件下XsMAX2高表达促进胚珠败育，外源营养补充抑制XsMAX2从而促进早期种子发育。独脚金内酯类似物GR24与ABA促进XsMAX2表达，其与PCD相关蛋白酶及细胞周期基因表达失调共同导致受精卵珠败育。这些发现揭示了文冠果在营养胁迫下通过整合独脚金内酯与ABA途径、经由XsMAX2决定胚珠命运以优化生殖成功的适应策略。后续研究应探索XsMAX2在PCD诱导及细胞周期控制中的直接靶标。