一种定量饲料加工过程中活屎肠球菌(Enterococcus faecium)的新方法——基于溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)-实时荧光定量PCR(qPCR)

《Poultry Science》：A Novel Method to Quantify Viable Enterococcus faecium During Feed Manufacturing

　　

摘要：屎肠球菌(Enterococcus faecium，E. faecium)在饲料加工过程中易受损伤，制粒饲料中活菌损失会导致益生菌功效降低。本研究旨在建立溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)-实时荧光定量PCR(qPCR)方法以定量饲料中活E. faecium，并考察不同包被( coating)技术在饲料加工过程中对其的保护作用。首先验证EF2引物组qPCR具有高扩增效率(E = 96.2%，R2= 0.997)且不与7种饲料常见菌种发生交叉反应；经流式细胞术(flow cytometry, FCM)和qPCR确定40 μM PMA可标记>99%死菌。研究人员通过培养法和PMA-qPCR考察生理盐水、柠檬酸钠及人工肠液对包被E. faecium释放游离细胞的影响，含胰酶(trypsin)的人工肠液可从包被E. faecium中释放94.2%活细胞(P < 0.05)。建立十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)辅助DNA提取法，使DNA提取效率提高54.3%(P < 0.05)。综上，所建PMA-qPCR方法灵敏度高(E = 101.1%；R2= 0.991)，对活/死菌混合样品活菌比例检测准确度高(实测值vs设定值，R2= 0.998)。进而采用裂-裂-裂区设计(split-split-plot design)利用该方法考察不同包被E. faecium在饲料加工中的存活：调质温度由65°C升至85°C时总存活率由72.4%降至12.2%(P < 0.05)；未包被及后包被(post-encapsulated)E. faecium在65°C下从调质到制粒存活率分别由85.7%降至8.1%、13.8%降至3.2%(P < 0.05)，冷却后无进一步变化；而前包被(pre-encapsulated)E. faecium在各加工步骤及各温度下存活率均显著高于未包被和后包被产品(P < 0.05)。结论：所建PMA-qPCR方法可有效定量饲料中活E. faecium；本研究测试的前包被E. faecium相较于未包被及后包被制剂对热及机械力具更佳抵抗力。

论文解读：《A Novel Method to Quantify Viable Enterococcus faecium During Feed Manufacturing》（发表于 Poultry Science）

一、研究背景与目的

屎肠球菌(Enterococcus faecium, E. faecium)是常用的饲用益生菌，其回肠定植量与肉鸡平均日增重正相关。然而饲料制粒过程中的高温蒸汽调质(conditioning)及环模挤压 pelleting 会对E. faecium造成热胁迫与机械损伤，导致活菌数大幅下降，削弱益生功效。传统平板计数法(plate count method)不仅耗时，且包被(coating/encapsulation)材料会阻碍菌体在琼脂上形成克隆，造成活菌低估；同时选择性培养基难以区分E. faecium与其他肠球菌或乳酸菌。实时荧光定量PCR(qPCR)虽快速特异，但无法区分死/活菌DNA。溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)可透过膜破损的死菌与DNA共价结合并在光解作用下阻止其扩增，从而选择性定量活菌。此外，微胶囊包被分为菌体发酵培养时即在基质内成囊的前包被(pre-encapsulated)与收获后再包埋的后包被(post-encapsulated)，二者对加工应力的保护效果尚需客观评价。为此，研究人员建立适用于含包被产品的饲料基质中活E. faecium定量的PMA-qPCR方法，并利用该法在模拟生产中比较三种E. faecium制剂的存活表现。

二、主要关键技术方法

研究人员选用E. faecium CICC 20430标准株，筛选特异引物并建立PMA最佳作用浓度（流式细胞术FCM验证）；针对包被产品优化释放液（含胰酶人工肠液）及CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)辅助DNA提取法以消除包材干扰；在灭菌玉米-豆粕基础日粮中添加三种E. faecium制剂（未包被、前包被、后包被，各添加量6 log₁₀CFU/g），采用中试环模制粒机按split-split-plot设计于65°C、75°C、85°C调质温度进行调质—制粒—冷却全流程取样，以建立之PMA-qPCR法定量各节点活菌并计算存活率，统计分析温度、加工步骤及包被形式的主效应与交互作用。

三、研究结果

Specificity of qPCR for E. faecium Amplification（E. faecium qPCR扩增特异性）

测试7对靶基因引物，仅EF2引物（靶recG基因）对E. faecium特异扩增且与7种饲料常见菌（芽孢杆菌属、大肠杆菌、乳杆菌属）无交叉反应；标准曲线E=96.2%，R²=0.997，检出限LOD为2 log₁₀CFU/反应，定量限LOQ为2.38 log₁₀CFU/反应。选定EF2用于后续qPCR。

Optimized Concentration of PMA for Labeling Inactivated E. faecium（失活E. faecium PMA标记的最佳浓度）

FCM显示40 μM PMA可使>99.6%加热致死E. faecium呈PMA阳性，且对活菌毒性最低（活菌PMA阳性<1.7%）；PMA-qPCR中活菌Ct值于0~40 μM稳定，死菌Ct值随PMA升高而增大。确定40 μM为最佳工作浓度。

Optimization of Releasing Solution and DNA Extraction for Coated E. faecium（包被E. faecium释放液与DNA提取优化）

生理盐水仅释放约34%包被菌，含胰酶人工肠液释放总细胞接近理论值且PMA-qPCR测得活细胞释放率达94.2%（P<0.05），显著高于其余溶液；添加CTAB处理突破包材多糖干扰，使DNA提取效率较商品化试剂盒提高54.3%（P<0.05）。

Sensitivity and Accuracy of PMA-qPCR Method in Quantifying Viable E. faecium in Feed（饲料中活E. faecium PMA-qPCR法的灵敏度与准确度）

灭菌饲料浸提液中建立标准曲线：Log₁₀CFU = -0.3034×Ct + 11.966（E=101.1%，R²=0.991），饲料样本水平LOD为3 log₁₀CFU/g，LOQ为3.97 log₁₀CFU/g。活/死菌梯度混合样品测得活菌占比与设定占比高度线性相关（R²=0.998），回归线与y=x截距(P=0.251)、斜率(P=0.415)均无显著差异，表明方法准确。

Survival of Viable E. faecium During Different Feed Processing Steps（不同饲料加工步骤中活E. faecium存活情况）

调质温度升高使整体存活率显著下降（65°C时72.4% → 85°C时12.2%，P<0.05）。未包被E. faecium在65°C调质后存活85.7%，制粒后骤降至8.1%（P<0.05），冷却无进一步变化；75°C与85°C下调质存活即较低且制粒后再降。后包被E. faecium在65°C下调质存活仅13.8%，制粒后3.2%（P<0.05），高温下近乎完全失活。前包被E. faecium在各温度下各工序存活率均无明显下降（65°C调质、制粒、冷却分别约118%、129%、131%，因混合均匀度波动略有超100%），且全程显著高于未包被及后包被制剂（P<0.05）。未包被调质后优于后包被（P<0.05），但制粒后差异消失。

四、讨论与结论总结

平板计数受包材抑制且不能反映膜损伤活菌，PMA-qPCR结合含胰酶人工肠液释放及CTAB辅助提取可克服上述局限，准确定量饲料及包被产品中活E. faecium，耗时约8 h，灵敏特异。调质高温为主要致死因素，但制粒时机械挤压与摩擦热对已被热弱化膜完整性的菌体造成二次显著损失，不可忽略。前包被E. faecium因菌体在基质内生长且包囊完整，可同时抵御调质热与制粒机械力；后包被工艺中干燥等步骤可能已损及菌体活力故保护性差；未包被虽无前置损伤但缺物理屏障。包被技术保护效果须经中试生产评估而非仅凭水浴模拟。

结论：本研究建立的PMA-qPCR方法灵敏、准确，适用于定量饲料（含包被产品）中活E. faecium。应用该方法证实前包被(pre-encapsulated)E. faecium相较于未包被(uncoated)及后包被(post-encapsulated)制剂在饲料加工中对热及机械力具更优抵抗能力；非所有包被技术均能提供有效保护，理想包被应兼具耐热与抗机械力并能于肠道环境释菌，且须经中试饲料加工验证。