一株新型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CG4菌株通过降低产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)NetB毒素减轻鸡坏死性肠炎(Necrotic Enteritis, NE)

《Poultry Science》：A novel Bacillus subtilis strain alleviates necrotic enteritis in chickens by reducing NetB toxin from Clostridium perfringens

　　

研究人员筛选健康鸡源野生型芽孢杆菌(Bacillus)菌株，旨在鉴定能降低产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)Ⅰ型G株毒素产生及鸡坏死性肠炎(Necrotic Enteritis, NE)病变的分离株，最终选中一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CG4。CG4的无细胞培养上清(Cell-Free Culture Supernatant, CFS)不抑制产气荚膜梭菌Ⅰ型G株的生长，但可显著降低该菌产生的NetB毒素（NE发病的关键毒素）水平，因此研究人员对其进行了体外表征与体内功效评价。体外研究中，CG4产孢量近3.0×108孢子/mL，在所测抗生素中仅对四环素(tetracycline)和青霉素(penicillin)表现抗性；CG4 CFS经加热及蛋白酶K处理敏感，提示活性物质为蛋白性质；CG4 CFS具较广谱蛋白水解(proteolytic)活性，可有效消化牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)及酪蛋白(casein)。在产气荚膜梭菌感染肉鸡试验中（三组：无处理组、单纯病原感染组、病原感染+CG4处理组，完全随机设计），饲料添加枯草芽孢杆菌CG4后，感染鸡NE病变评分(p ≤ 0.05)显著低于单纯感染组——CG4处理组平均NE评分为2.47，单纯产气荚膜梭菌感染组为3.75，未处理组无NE病变；此外CG4处理鸡在试验末期体重显著增加(p ≤ 0.05)，推测与CG4的蛋白水解活性有关。

一、研究背景与意义

坏死性肠炎（Necrotic Enteritis, NE）是由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）Ⅰ型G株分泌关键毒力因子NetB毒素（necrotic enteritis B-like toxin，属于β-桶状孔形成毒素家族，分子量约33 kDa）引起的肉鸡重要肠道疾病，造成肠黏膜损伤、营养吸收障碍及高死亡率，全球家禽业年损失约60亿美元。后抗生素时代亟需非抗生素替代防控手段，传统益生菌多通过抑菌或杀菌作用控制NE，存在诱导病原菌耐药风险；而抗毒力（anti-virulence）策略靶向关键致病因子而非细菌存活，可减轻选择压力。已有研究表明芽孢杆菌（Bacillus）尤其枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具肠道定植稳定性与蛋白分泌能力，但鲜见直接中和NetB毒素的菌株报道。本研究从健康鸡肠道及粪便中筛选不抑制产气荚膜梭菌生长但可降低其NetB毒素水平的Bacillus subtilis CG4，通过体外实验与肉鸡攻毒模型验证其通过胞外蛋白水解活性降解NetB毒素从而减轻NE病变并改善生长性能，为以抗毒力为核心的NE防控提供新思路。本研究发表于《Poultry Science》。

二、主要关键技术方法

研究人员从加拿大安大略省无抗生素饲喂蛋鸡肠道、肉鸡肠道及鸡粪样品经80℃ 10 min热选择性处理、LB平板分离、16S rRNA鉴定获Bacillus分离株；以微量稀释生长抑制试验筛出对C. perfringens CP1（Type G，NE临床分离株）无抑制作用的Bacillus subtilis，以其CFS与CP1共培养，免疫印迹（immunoblot）检测NetB毒素（～33 kDa）带消失情况确定降毒活性菌株CG4；采用琼脂扩散法及最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）试条测定CG4抗生素敏感性；Difco产孢培养基（Difco Sporulation Medium, DSM）培养5 d镜检及菌落计数评估产孢能力；将CG4 CFS分别进行100℃不同时间及蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）预处理后行抗NetB产生试验判断活性物质性质；将CP1 CFS与CG4 CFS混合孵育后immunoblot检测NetB带变化确认是否为降解作用；以BSA及酪蛋白为底物行SDS-PAGE考马斯亮蓝染色验证CG4 CFS广谱蛋白水解活性。动物试验采用52只1日龄Ross 708公雏完全随机分三组——阴性对照（NC，无感染无CG4）、阳性对照（PC，C. perfringens CP1口服攻毒，≥3×10⁸CFU/羽，d22、d23每日2次）、处理组（CP1攻毒+饲粮添加B. subtilis CG4芽孢10⁶CFU/g全期），d24剖检按0–6分评估小肠NE病变，记录体重，检测粪便及回肠食糜Bacillus与C. perfringens负荷。

三、研究结果

Cellular location of NetB toxin in C. perfringens cultures（产气荚膜梭菌培养物中NetB毒素的细胞定位）

免疫印迹显示NetB毒素条带（～33 kDa）主要出现在CP1与CP4的无细胞培养上清（CFS）中，细胞沉淀中未检出，netB阴突变株（netB^-）无对应条带，证实NetB为分泌至胞外的毒素，为后续用Bacillus CFS共培养检测降毒效果提供依据。

Antimicrobial and anti-NetB activities of B. subtilis strains against C. perfringens（枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌的抗菌及抗NetB活性）

初筛约100株Bacillus，30株不抑制CP1生长且均为B. subtilis；免疫印迹仅B. subtilis CG4 CFS可完全消除CP1产生的NetB毒素条带，且该降毒效果在CG4 CFS 4倍稀释内仍可检测到，高于8倍稀释失效，表明CG4具特异性降NetB能力。

Antibiotic resistance and spore formation of B. subtilis CG4（B. subtilis CG4的抗生素抗性及产孢能力）

CG4仅对四环素及青霉素MIC试条表现抗性，对其余测试抗生素（氨苄西林、红霉素、环丙沙星、杆菌肽、萘啶酸、氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、万古霉素、庆大霉素）敏感；培养5 d后产孢率约99%，孢子浓度近3.0×10⁸孢子/mL，符合饲用益生菌耐加工与肠道存活要求。

Sensitivity of NetB-reducing component in CG4 CFS to heat and protease treatments（CG4 CFS中降NetB组分对热及蛋白酶的敏感性）

CG4 CFS经80℃ 1 min或100℃ 1–10 min加热后丧失降NetB活性；经蛋白酶K（56℃, 30 min）消化后也丧失活性，但胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）消化不影响其降NetB能力；热灭活蛋白酶对照组无影响。综合表明CG4 CFS中降NetB活性物质为蛋白（proteinaceous）性质，且对热及特定蛋白酶敏感。

Proteolytic activity in CG4 CFS（CG4 CFS中的蛋白水解活性）

将CP1 CFS（含NetB毒素）与CG4 CFS混合后37℃孵育16 h，免疫印迹示NetB条带随CG4 CFS稀释度升高渐恢复，16 h孵育组在CG4 CFS 16倍稀释内仍可见NetB降解，未孵育对照组无此现象，排除单纯结合或抑制检测而确认为真正降解。另BSA与酪蛋白在CG4 CFS作用下于SDS-PAGE中呈浓度依赖性降解，证实CG4 CFS具广谱蛋白水解活性，NetB毒素为其底物之一。

Reduction of C. perfringens–induced NE lesions in broilers by B. subtilis CG4（枯草芽孢杆菌CG4降低产气荚膜梭菌诱导的肉鸡NE病变）

阳性对照组平均NE病变得分3.75±0.43，CG4处理组降至2.47±0.41（p＝0.04），阴性对照组为0；NE发病率CG4组75% vs 阳性对照组84%（p＞0.05）。CG4添加组粪便及回肠食糜Bacillus计数显著高于未添加组（p＜0.001），d23粪便C. perfringens计数CG4组显著低于阳性对照组（p＝0.002），d24回肠食糜中二者无差异。体重方面d14三组无差异；d24 CG4处理组1087.4±25.61 g显著高于阳性对照组971.6±18.74 g（p＝0.005）及阴性对照组932.5±39.45 g（p＜0.001），表明CG4减轻NE病变并改善生长性能。

四、讨论与结论总结

讨论指出本研究区别于传统抑菌型益生菌，筛选策略聚焦于不抑制病原菌生长但降低关键毒力因子NetB，减少耐药选择压；CG4通过分泌具广谱底物的胞外蛋白酶降解NetB毒素（其结构含无序环及芳香残基富集区易被蛋白酶切），此为首次报道B. subtilis蛋白酶通过降解NetB减轻鸡NE。参照已有益生菌蛋白酶降解艰难梭菌（C. difficile）毒素的研究佐证该机制合理性。CG4参考菌株ZK3814（具群体感应抑制活性）无降NetB作用，提示C. perfringens群体感应系统不同于金黄色葡萄球菌（S. aureus）agr系统。与既往B. subtilis PB6等株仅降病变或无促生长效应不同，CG4同时显著改善末重。综上，B. subtilis CG4具强蛋白水解活性，可在体外降解C. perfringens NetB毒素且不抑制其生长，饲料添加CG4芽孢可显著降低攻毒肉鸡NE病变严重程度并提升体重，支持以抗毒力策略防控家禽NE，表明具特定蛋白水解活性的Bacillus菌株可作为改善肠道健康与生长性能的潜在饲用添加剂，后续需进一步明确CG4蛋白酶具体种类及直接验证其单独酶组分在体内的NE缓解作用。

研究结论（翻译自原文Conclusion）：

本研究表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CG4具有强蛋白水解（proteolytic）活性，可在体外降解产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）产生的NetB毒素，并在产气荚膜梭菌感染的肉鸡中降低坏死性肠炎（Necrotic Enteritis, NE）病变。此外，饲料中添加CG4可提高鸡只体重。这些结果支持采用抗毒力（anti-virulence）策略防控家禽NE。CG4降低NE毒素及提高鸡体重的效果表明，具强蛋白水解活性的特定芽孢杆菌（Bacillus）菌株在控制肠道疾病及促进动物生长方面具有应用潜力。但仍需进一步研究以直接证明CG4所产蛋白酶在缓解NE中的功能。