《Nature Immunology》：Human vaccine responses regulated by parallel cytokine pathways
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研究人员分析了四个季节（n=581）66种细胞因子的灭活流感疫苗（IIV）队列数据，发现基线血清白细胞介素（IL）-18和干扰素（IFN）-β是第28天抗体应答的相关因素。为验证因果关系，研究人员在人类扁桃体和脾脏类器官中评估了19种细胞因子，发现I型IFN、
研究人员分析了四个季节（n=581）66种细胞因子的灭活流感疫苗（IIV）队列数据，发现基线血清白细胞介素（IL）-18和干扰素（IFN）-β是第28天抗体应答的相关因素。为验证因果关系，研究人员在人类扁桃体和脾脏类器官中评估了19种细胞因子，发现I型IFN、IL-21和IL-12增强抗体产生，但IL-18或IFNγ无此作用。将IFNβ添加至IIV可重现活疫苗细胞因子程序的关键特征。IL-12和IL-21定义了独立于I型IFN的平行通路，其中IL-12可在人类中诱导IL-21产生，这与小鼠不同。通过mRNA脂质纳米颗粒（LNP）在体内递送IL-21或IFNβ可促进长寿命浆细胞形成。这些发现共同定义了调控疫苗免疫的平行通路。该研究方法整合了高通量类器官测试和人类队列研究，建立了以人类为中心的平台来识别佐剂候选物。
流感是全球重大公共卫生挑战，每年约有8亿人接种流感疫苗，其中98%接受灭活流感疫苗（Inactivated Influenza Vaccine, IIV）。然而，IIV诱导的特异性抗体应答差异显著，总体保护率仅在20%至60%之间波动，且老年人群体（>65岁）承受最重的流感相关发病率和死亡率负担。理解区分强应答者与弱应答者的免疫学因素，对于阐明疫苗应答机制并寻求改进策略至关重要。既往研究表明，尽管疫苗应答特异性由宿主遗传学决定，但应答幅度的变异性主要由非遗传性因素驱动，包括既往巨细胞病毒感染和肠道微生物群等。多个综合研究已表征了与流感疫苗改良抗体应答相关的接种前或接种后早期免疫转录组特征，其中若干特征包含干扰素诱导基因，但究竟是I型还是II型干扰素介导这些特征、以及它们是相关性还是因果性关系，此前尚不明确。为此，研究人员开展了此项研究，旨在从人类队列中筛选与疫苗应答相关的细胞因子，并通过人类免疫类器官系统验证其因果效应，最终建立以人类为中心的佐剂筛选平台。该研究成果发表于《Nature Immunology》。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：基于Luminex的多重液相芯片技术对581名参与者进行66种血清细胞因子检测；建立低细胞输入量的人类扁桃体和脾脏类器官高通量筛选体系，采用NULISA技术进行250种细胞因子/趋化因子的DNA条形码多重检测；运用mRNA脂质纳米颗粒（LNP）在体细胞因子递送平台；以及定制Luminex病毒抗体检测芯片和骨髓ELISpot技术评估抗体应答广度与长寿命浆细胞形成。
**基线抗体滴度塑造疫苗应答**
研究人员首先分析了四个流感疫苗队列五个季节的数据。发现pre-VAX流感血凝抑制（Hemagglutinin Inhibition, HAI）抗体滴度与post-VAX抗体应答存在显著异质性。将人群按pre-VAX抗体滴度四分位分层后，发现pre-VAX抗体水平较低者具有更高的应答中位数和动态范围，而pre-VAX抗体水平较高者应答减弱，推测可能由于抗原清除加速导致疫苗"接种成功"率降低。值得注意的是，老年个体疫苗应答降低的现象仅在pre-VAX抗体水平较低的参与者中显现，这表明低pre-VAX抗体滴度是检测疫苗应答生物学决定因素的关键背景条件。在pre-VAX HAI滴度低于40（视为未保护）的389名参与者中，89%属于pre-VAX抗体水平低的人群，因此后续分析聚焦于该群体。
**基线细胞因子与疫苗应答相关**
研究人员对四个队列的66种细胞因子进行荟萃分析，鉴定出pre-VAX血清中两种细胞因子——IL-18和IFNβ，以及一种趋化因子GRO-α（也称为CXCL1）的丰度与post-VAX抗体应答显著相关（错误发现率<5%）。IFNβ作为I型IFN成员，具有最高的I型IFN受体（IFNAR1/2）结合亲和力，该受体表达于包括B细胞在内的多种细胞类型。此外，辅助性T细胞（T
H）因子IL-17和IL-9显示出边缘显著相关性（FDR<10%）。
**人脾脏类器官鉴定细胞因子佐剂**
为区分相关性与因果性，研究人员开发了低细胞输入的免疫类器官培养系统（细胞输入量减少97%至1.6×10
5个细胞），实现96孔板格式的高通量筛选。他们从临床获取3例扁桃体组织，并通过Donor Network West获取2例授权机械通气死亡供者的脾脏组织，建立了5组独立供者的类器官。在添加IIV的同时联合19种不同细胞因子，每种测试三个浓度（1–100 ng·ml
-1，IL-1β和IL-18分别调整）。结果显示，所有I型IFN（IFNβ和IFNω，IFNα效果较弱）均增强IIV诱导的抗体产生；IL-21、IL-9、IL-12和IL-10也显示强效佐剂功能，多数因子在1 ng·ml
-1低浓度即可检测效应。然而，IL-18及其下游效应分子II型IFN（IFNγ）并未增强IIV诱导的抗体应答，与人类队列中的强相关性形成对比，表明人类免疫类器官能够功能区分直接增强抗体应答的细胞因子与单纯相关因子。
**I型IFN模拟活疫苗应答**
研究人员进一步分析疫苗诱导的细胞因子谱。IIV刺激脾脏类器官后，II型IFN（IFNγ）最为显著诱导，但无任何I型IFN被诱导。相比之下，减毒活流感疫苗（Live Attenuated Influenza Vaccine, LAIV）除诱导与IIV共同的T
H细胞因子（IL-5、IL-13、IL-4）、TH9细胞因子（IL-9）和II型IFN外，还独特且显著地诱导I型和III型IFN应答，浓度高达IIV的约1000倍（10 log2），同时伴随IL-10、IL-12、CCL-7和CXCL-10等广谱细胞因子。
向未接种的脾脏类器官添加IFNβ后，其诱导的细胞因子谱与LAIV-IIV差异诱导的细胞因子高度重叠：14种LAIV-IIV差异上调细胞因子中的13种同样被IFNβ诱导，5种差异下调细胞因子中的4种同样被IFNβ抑制。因此，IFNβ处理的类器官细胞因子表型模拟了活疫苗处理的样本。这种表型复制包括IFNβ诱导其他I型IFN（IFNα和IFNω）的表达，暗示I型IFN之间存在正反馈环路。功能验证显示，IIV在诱导I型IFN活性方面存在缺陷，而添加IFNβ可挽救这一缺陷；LAIV虽高效诱导I型IFN活性，但额外添加IFNβ不再增强，提示饱和效应。抗体产生与I型IFN活性呈正相关。
**IFNβ调控老年低剂量应答者**
研究人员发现IFNβ与post-VAX抗体应答的相关性在不同亚群中存在显著异质性，主要由年龄差异导致，仅在老年群体（>65岁）中达到显著性，且该相关性在低剂量疫苗接种者中更为显著。2014–2015赛季将老年人切换至高剂量抗原疫苗后，基线IFNβ浓度与抗体应答的关联消失。进一步分析Stanford–Ellison纵向队列（流感疫苗研究15号），发现骨关节炎与血清IFNβ丰度存在最强关联：IFNβ在诊断前长达4年即显著升高，并持续至诊断后5年；该时间段内骨关节炎患者的流感疫苗抗体应答显著升高。因此，骨关节炎这一高龄相关高发疾病是IFNβ丰度和疫苗应答的修饰因子，鉴定IFNβ为老年人低剂量疫苗应答的选择性调节因子。
**IL-12和IL-21定义活疫苗通路**
在免疫类器官筛选中，IL-12和IL-21被鉴定为活疫苗特异性细胞因子，但位于I型IFN通路之外。IL-12可在人类类器官中诱导IL-21表达，这与小鼠模型中IL-12不能诱导CD4+ T细胞表达IL-21形成物种差异。既往研究表明IL-12是诱导IL-21表达CD4+ T细胞的有效因子，后者负责B细胞"辅助"。这些数据支持人类疫苗应答至少存在两种细胞因子通路：I型IFN通路和与之平行的IL-12–IL-21通路。
**mRNA LNP增强小鼠疫苗应答**
研究人员在体评估IFNβ和IL-21的功能相关性，采用编码细胞因子的mRNA LNP平台。该平台的mRNA成分可诱导强烈I型IFN应答，LNP成分则促进T滤泡辅助细胞（TFH）活化——IL-21的主要来源。小鼠免疫实验显示，1 μg IIV单独未能诱导可检测的抗体应答，而联合GFP mRNA LNP显著增强所有疫苗株HAs的抗体滴度，并产生交叉反应性抗体应答，包括针对H5N1等人畜共患株的应答。进一步测试mRNA LNP编码特定细胞因子：IL-21 mRNA LNP在第35天优于GFP mRNA LNP提升抗体滴度；12个月时，IL-21和IFNβ mRNA LNP均产生约5倍于GFP mRNA LNP的抗体滴度，减缓抗体衰减。骨髓B细胞ELISpot证实，两种细胞因子mRNA LNP均显著促进抗原特异性长寿命浆细胞形成，提示细胞因子mRNA通过增强长寿命浆细胞持久性来维持抗体产生。
**讨论总结与结论**
研究人员结合相关性和干预性研究，鉴定IL-18、GROα/CXCL1和IFNβ的pre-VAX丰度与流感疫苗抗体应答相关，这些关系在pre-VAX HAI滴度低者中最为显著，突出了基线免疫分层对于揭示疫苗应答决定因素的重要性。IFNβ被确认为能够增强人群抗体应答的天然佐剂，添加单一I型IFN（IFNβ）即可重现活疫苗特异性免疫激活程序的大部分特征，将灭活疫苗应答推向活疫苗样状态。更重要的是，I型IFN被鉴定为选择性影响高风险群体——老年低剂量接种者——疫苗应答的免疫调节因子。
研究同时鉴定了独立于I型IFN的第二通路IL-12/IL-21。尽管I型IFN信号缺陷者的先天抗病毒防御严重受损，其仍可产生体液应答，如IFNAR1缺陷患者接种黄热病疫苗后产生中和抗体，表明B细胞启动和抗体产生可不依赖完整I型IFN信号。人类脾脏类器官中IL-12诱导IL-21，而IL-12可直接调控B细胞功能。
mRNA LNP作为I型IFN和IL-21的强效诱导剂，增强了抗体应答的持久性。值得注意的是，IFNβ mRNA LNP在不增加峰值抗体滴度的情况下实现长期效应。相较于既往以蛋白质形式评估的细胞因子佐剂，mRNA LNP编码细胞因子提供了灵活策略。但LNP脂质成分可诱导广泛炎症效应，未来需开发免疫惰性脂质以提高精准性和安全性。
研究强调人类与小鼠疫苗应答的差异：小鼠中IL-12不诱导CD4+ T细胞表达IL-21，而人类中则可诱导；多种在小鼠模型中增强流感疫苗应答的细胞因子在人类类器官中无效，可能反映人类回忆应答与小鼠初次应答的差异及更广泛的物种特异性效应。随着美国FDA计划采用"人类相关方法"进行药物评估，此项研究整合高通量类器官测试与人类队列研究，建立了以人类为中心的佐剂候选物识别平台，为疫苗佐剂开发提供了新范式。
