基于mRNA的结核病疫苗BNT164a1和BNT164b1在啮齿动物模型中具有免疫原性、良好耐受性及保护效力

《Nature Immunology》：mRNA-based tuberculosis vaccines BNT164a1 and BNT164b1 are immunogenic, well tolerated and efficacious in rodent models

　　

研究人员设计并在临床前对两种基于mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）的结核病保护性疫苗候选物进行了测试。BNT164a1和BNT164b1编码相同的8种结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）抗原，这些抗原覆盖感染的不同时期：Ag85A、Hrp1、ESAT-6、RpfD、RpfA、HbhA、M72和VapB47。BNT164a1采用未经核苷修饰的mRNA，BNT164b1采用N1-甲基假尿苷修饰mRNA。采用初免-加强免疫后，BNT164候选疫苗在3种小鼠品系（C57BL/6、BALB/c和HLA-A2.1/DR1人源化小鼠）中均诱导出针对全部抗原的抗体和/或T细胞应答。两种候选疫苗在大鼠毒理学研究中表现出良好的安全性特征，并在小鼠气溶胶攻击模型中显著降低了两种Mtb菌株的细菌负荷。BNT164介导的保护与具有记忆前体表型的CD8⁺ T细胞向肉芽肿浸润相关。总之，BNT164a1和BNT164b1在临床前模型中具有免疫原性、良好耐受性和保护效力，且已进入1/2期临床试验（NCT05537038，NCT05547464）。

这篇发表于《Nature Immunology》的研究聚焦于结核病（tuberculosis, TB）新型疫苗的研发。结核病仍是由单一传染性病原体——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）导致死亡的主要原因之一。现有标准抗结核治疗疗程长、需联合多种抗生素且伴随多类不良反应，同时还可能促进耐药菌出现。当前唯一获批的卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin, BCG）虽然可在儿童期预防重症结核，但对青少年和成人肺结核的保护有限，且不适用于免疫功能低下人群。由于青少年和成人肺结核不仅疾病负担最高，也是传播的主要来源，因此研发一种耐受性良好、保护有效且持久的疫苗具有迫切意义。

研究背景中的核心难点在于，Mtb感染并非单一静态过程，而是从无症状到有症状疾病、从细菌清除到播散死亡的连续谱，肺内不同病灶之间还存在显著异质性。宿主免疫状态与细菌代谢适应共同塑造了活跃复制、非复制和再激活等不同感染状态，因此面向青少年和成人的有效疫苗很可能需要同时靶向多个在不同感染阶段表达的抗原。与此同时，人群中缺乏明确的保护相关指标（correlates of protection），也使结核疫苗开发更为复杂。既往研究提示CD4⁺辅助性1型T细胞（T helper 1, T_H1）、IFNγ和TNF与抑制Mtb感染有关，但越来越多证据显示，T滤泡辅助样细胞、T_H17细胞、MHC限制性或非限制性的Mtb特异性CD8⁺ T细胞以及体液免疫同样可能参与保护。基于mRNA平台能够同时诱导细胞免疫和体液免疫，并具备多抗原编码及快速放大的优势，研究人员据此提出以mRNA平台开发结核疫苗的策略。

研究人员据此构建了两种多抗原mRNA-LNP候选疫苗BNT164a1和BNT164b1。二者编码相同的8种Mtb全长抗原，并分布于4条mRNA上，每条mRNA编码2种抗原融合蛋白；两者唯一差异在于RNA化学形式：BNT164a1为未修饰RNA，BNT164b1为N1-甲基假尿苷修饰RNA。研究围绕免疫原性、安全性和保护效力三个维度展开系统评估，旨在判定这两种候选疫苗是否具备进一步临床开发价值。结果表明，两种候选疫苗均可在多种小鼠模型中诱导广泛抗原特异性T细胞和抗体应答，在大鼠重复给药毒理学研究中表现出可接受的安全性，并在两种不同Mtb菌株攻击模型中显著降低肺和脾的细菌负荷。研究的整体意义在于，它为结核病多抗原mRNA疫苗提供了系统的临床前证据，推动了该策略向人体临床试验过渡。

作者采用的主要关键技术方法包括：基于mRNA-LNP平台构建4条编码双抗原融合蛋白的mRNA，并通过HEK293T细胞转染结合免疫印迹（western blot）验证体外表达；在C57BL/6、BALB/c及HLA-A2.1/DR1人源化小鼠中实施初免-加强免疫，通过ELISpot、流式细胞术和ELISA评估细胞与体液免疫；在符合GLP的大鼠重复给药毒理学研究中评估安全性；在C57BL/6小鼠低剂量气溶胶攻击模型中使用H37Rv和HN878两种菌株检测肺与脾菌落形成单位（CFU）、肺组织病理学及感染后肺和纵隔淋巴结免疫细胞表型；并结合AlphaFold2进行融合抗原结构预测分析。

在结果部分，论文首先以“Vaccine design”说明疫苗设计逻辑。研究人员采用多抗原策略以扩大免疫覆盖范围，将Ag85A、ESAT-6、VapB47、Hrp1、RpfA、RpfD、M72和HbhA分配到4条mRNA中，形成4种双抗原融合蛋白。所选抗原覆盖Mtb感染不同阶段，并具有既往的人体或动物免疫原性、保护性证据。为适应结核高流行地区人群复杂的HLA多样性，研究人员尽可能采用全长抗原设计，以保留更多CD4⁺和CD8⁺ T细胞表位。结构建模提示，大多数融合抗原与单独抗原的结构高度重叠，支持其具有维持天然构象并诱导相关免疫应答的潜力。

在“mRNA-encoded antigens are expressed in vitro”部分，研究人员通过HEK293T细胞转染和免疫印迹证实，BNT164a1与BNT164b1编码的8种抗原均可在体外成功表达，并且在单独转染与4条mRNA混合递送时未观察到明显翻译干扰。Hrp1相关检测还显示Ag85A–Hrp1融合蛋白可形成单体和二聚体，提示其部分天然分子特征在融合构建后仍得以保留。这一结果为后续免疫学评价提供了表达层面的依据。

在“BNT164 candidates elicit cellular and humoral immunogenicity in mice”部分，研究人员系统评估了免疫原性。T细胞方面，BNT164b1在C57BL/6小鼠中诱导的IFNγ分泌细胞数高于BCG。进一步分析显示，BNT164a1和BNT164b1均可在C57BL/6和BALB/c小鼠中诱导针对8种抗原各自的CD4⁺和/或CD8⁺ T细胞应答；在人HLA-A2.1/DR1人源化小鼠中，同样观察到针对全部抗原的特异性T细胞应答，提示该疫苗设计具有跨MHC/HLA背景的免疫覆盖能力。流式细胞术进一步表明，两种候选疫苗均可诱导分泌IFNγ、IL-2、TNF的单阳性及多功能（polyfunctional）CD4⁺和CD8⁺ T细胞，并形成记忆前体效应细胞（memory precursor effector cells, MPEC）及长寿命记忆前体细胞（long-lived memory precursor, LLMP）。其中BNT164a1诱导的CD8⁺细胞因子分泌和记忆前体比例高于BNT164b1。体液免疫方面，两种候选疫苗在C57BL/6和BALB/c小鼠中可诱导针对多数目标抗原的IgG应答，但对ESAT-6和RpfD未检测到明显IgG；在人源化小鼠中IgG应答较弱。总体上，该部分证明BNT164可在多种遗传背景下诱导广谱细胞和体液免疫。

在“Antigen interference”部分，研究人员考察了多价疫苗中可能存在的抗原干扰。将完整BNT164b1与各单独抗原模块比较后发现，部分抗原如Hrp1、ESAT-6、RpfA和HbhA在T细胞应答上存在一定程度干扰；IgG层面ESAT-6单独接种可诱导抗体，但在八价组合中该反应消失。由于ESAT-6和RpfD主要作为T细胞抗原纳入，因此研究人员认为这种干扰仍在可接受范围内，且大多数抗原特异性免疫应答得以保留。

在“Durability and boostability”部分，研究人员对免疫持久性和再激活能力进行了评估。两剂免疫后，部分抗原特异性IgG滴度从第42天到第133天缓慢下降；但第134天实施第3剂免疫后，针对RpfA、HbhA、M72和VapB47等抗原的抗体反应可被有效提升至接近或超过第42天水平。第三剂后脾细胞T细胞应答也与第二剂后相当或更高。利用Mtb H37Rv裂解物ELISA还发现，第3剂免疫后血清IgG对天然细菌抗原的结合增强，说明加强免疫提高了对天然构象抗原的识别能力。

在“BNT164 candidates show a favorable safety profile in rats”部分，研究人员在Wistar Han大鼠中开展符合GLP的重复给药毒理学研究。结果显示，BNT164a1和BNT164b1未引起与疫苗相关的全身性临床症状、死亡或体重变化，也未见明显尿液学异常。局部组织学可见注射部位肌纤维损伤及炎症反应，但多在恢复期部分或完全缓解。血液学和急性期蛋白指标显示短暂、剂量依赖性的炎症反应，包括白细胞、中性粒细胞及纤维蛋白原、α₂-巨球蛋白和α₁-酸性糖蛋白升高。不可翻译对照mRNA-LNP亦产生类似效应，提示这些炎症变化主要与制剂介导的先天免疫激活有关，而非抗原本身所致。整体上，两种候选疫苗耐受性良好。

在“BNT164 candidates reduce the bacterial burden in Mtb-challenged mice”部分，研究人员在C57BL/6小鼠中建立低剂量气溶胶攻击模型，分别使用H37Rv和高毒力HN878菌株。结果显示，无论对H37Rv还是HN878，BNT164a1和BNT164b1均可在感染后显著降低肺和脾中的细菌负荷，降幅约为0.55–1.0 log。不可翻译对照未显示类似保护，提示保护主要依赖抗原特异性免疫。组织病理学进一步显示，BNT164免疫组肺内含抗酸杆菌的肉芽肿比例下降，且细菌负荷降低与淋巴细胞浸润增加呈负相关；相对地，盐水和对照组肉芽肿中中性粒细胞较多。该部分证明BNT164不仅可诱导免疫反应，而且能够在感染挑战中转化为实质性保护效果。

在“BNT164 candidates induce CD8⁺ T cells with memory precursor phenotypes”部分，研究人员进一步分析了保护相关免疫特征。肺组织流式结果显示，BNT164免疫后肺内CD8⁺ T细胞频率增加，其中相当比例为CD44⁺且Mtb32A四聚体阳性的抗原特异性细胞。经肽池刺激后，这些肺部CD8⁺ T细胞可分泌IFNγ和TNF，说明其具有功能活性。更重要的是，约70%的Mtb32A四聚体阳性CD8⁺ T细胞表现为MPEC表型，并伴随LLMP细胞增加，而短寿命效应细胞（short-lived effector cells, SLEC）比例下降。与肺不同，纵隔淋巴结中这种富集程度较弱。研究人员据此认为，BNT164诱导的抗原特异性CD8⁺ T细胞可迁移至主要感染部位肺，并呈现与长期免疫相关的记忆前体特征，这与观察到的保护效应一致相关。

讨论部分强调，这两种候选疫苗的突出特点在于多抗原、跨感染阶段覆盖及mRNA平台的可塑性。研究显示，不同小鼠模型间T细胞应答差异主要受MHC/HLA背景影响，而并非抗原递送或表达失败，因此支持保留8种抗原的组合方案。尽管BNT164a1与BNT164b1在CD8⁺多功能性和记忆前体形成上存在一定差别，但在整体保护效力上未显示稳定显著差异，提示两种RNA化学形式均具备开发潜力。作者同时指出，结核动物模型对人体保护的预测能力有限，小鼠中宿主-病原相互作用、抗原表达时相和MHC谱均存在局限，因此临床外推仍需谨慎。不过，本研究获得的广谱免疫、剂量相关且可逆的炎症安全特征，以及对两种Mtb谱系的保护效果，共同构成了进一步临床开发的重要依据。

研究结论部分可概括为：临床前数据表明，结核病mRNA疫苗候选物BNT164a1和BNT164b1具有良好的免疫原性、耐受性和保护效力，支持其继续推进临床开发。目前BNT164a1和BNT164b1已进入1/2期临床试验，其安全性和免疫原性正在接受评估。