宿主–病毒因子决定埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)在人脑类器官模型中持续感染(Productive Persistence)的机制

《Nature Microbiology》：Host–virus determinants of Ebola virus persistence in a human cerebral organoid model

　　

摘要：埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)引起埃博拉病毒病(Ebola virus disease, EVD)，为一种伴极高病死率的多系统人类疾病。EVD幸存者可出现炎症复发，并伴有病毒在免疫豁免组织（包括中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)）中的持续存留。持续性(Persistence)定义为急性期后EBOV基因组持续复制，可能导致病毒粒子(Virion)产生。生产性持续感染(Productive persistence)与EVD疫情的重新点燃有关。研究人员建立了人脑类器官(Cerebral Organoid, CerOrg)模型以探究EBOV在CNS中持续感染的宿主及病毒决定因素。在该模型中，EBOV可持续感染达120天，由星形胶质细胞(Astrocyte)和神经元(Neuron)的持续感染以及小胶质细胞(Microglia)的募集与感染所维持。此过程伴随EBOV缺陷病毒基因组(Defective Viral Genome, DVG)及基因组亚变异株(Subvariant)的出现、细胞间传播(Cell-to-cell transmission)、细胞特异性天然免疫(Innate Immunity)激活以及晚期脑类器官炎症，表明EBOV在免疫豁免微环境中的持续感染可驱动局部炎症。

研究背景与概述

埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)属丝状病毒科(Filoviridae)，引起的埃博拉病毒病(Ebola virus disease, EVD)病死率极高。临床证据表明EVD幸存者体内EBOV可在免疫豁免部位（如眼玻璃体、精液、脑脊液及中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)）持续存留数月甚至数年，导致葡萄膜炎、致命性脑膜脑炎及疾病复发，并成为疫情再燃的源头。然而，EBOV在人体内持续感染的病理生物学机制——特别是其在CNS中的细胞靶点、病毒与宿主相互作用及演化特征——尚不清楚。由于非人灵长类(Non-human Primate, NHP)模型和人体取材受限，缺乏合适的体外模型是研究瓶颈。本研究由德国Bernhard Nocht热带医学研究所等单位完成，发表于《Nature Microbiology》，研究人员利用人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cell, hiPSC)来源的人脑类器官(Cerebral Organoid, CerOrg)模拟EBOV在CNS中的持续感染，系统解析了宿主–病毒决定因素，发现EBOV（及同为丝状病毒的苏丹病毒SUDV、莱斯顿病毒RESTV、马尔堡病毒MARV）可在含神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞的CerOrg中建立长达120天的生产性持续感染(Productive Persistence)，伴随缺陷病毒基因组(Defective Viral Genome, 5′cb-DVG)积累、病毒基因组亚变异、细胞间传播及晚期炎症，而沙粒病毒(Lassa virus, LASV)则不能建立同类持续感染。

主要关键技术方法

研究人员构建含内源性小胶质细胞的hiPSC来源人脑类器官(CerOrg，两株不同性别hiPSC系HMGU1和SCTi003-A)，于成熟后暴露于EBOV（野生型及重组绿色荧光蛋白标记rgEBOV-GFP、rgRESTV-GFP）、SUDV、RESTV、MARV及LASV，纵向监测上清感染性病毒粒子（焦点形成单位Focus-Forming Unit, f.f.u.）及病毒RNA；通过免疫荧光/免疫组化共染色鉴定EBOV核蛋白(Nucleoprotein, NP)在各脑细胞类型（RBFOX3⁺成熟神经元、GFAP⁺星形胶质细胞、CD68⁺小胶质细胞、少突胶质细胞Oligodendrocyte）中的分布；对持续感染细胞系（永生化小胶质细胞、星形胶质细胞）及CerOrg进行批量转录组测序(Bulk RNA-seq)分析差异表达基因(Differentially Expressed Gene, DEG)；通过5′拷贝反向缺陷病毒基因组(5′ copyback DVG, 5′cb-DVG) RT–qPCR及透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)检测DVG与缺陷干扰颗粒(Defective Interfering Particle, DIP)；采用有限稀释法分离EBOV亚变异株(Subvariant)并进行深度测序及多细胞系/类器官复感染功能验证；ELISA/液相芯片检测类器官上清炎性细胞因子/趋化因子释放谱。

研究结果

Distinct type I interferon signatures in persistently infected microglia and astrocytes

研究人员将EBOV分别感染永生化人小胶质细胞和星形胶质细胞，在低感染复数(Multiplicity of Infection, MOI)下不经传代也可持续感染≥25天。通过批量RNA测序发现：持续感染的小胶质细胞中强效上调I型干扰素(Interferon type I, IFN-I)介导的抗病毒基因（OAS1/2/3/L、MX2）、促炎细胞因子（IL1B、IL6）、BST2、ISG15及模式识别受体（TLR3、IFIH1/RIG-I、DHX58），并在长期传代(91天)后出现IFNB1晚时相上调及IRF7早期上调后下调；而持续感染的星形胶质细胞虽支持EBOV生产性复制但不产生显著的IFN-I响应。Lassa病毒(LASV)在小胶质细胞中因致细胞病变效应(Cytopathic Effect, CPE)无法建立持续感染，在星形胶质细胞中呈波浪式复制但最终清除，说明EBOV特异的持久感染伴随细胞类型依赖的天然免疫特征。

Ebola virus and other filoviruses persistently replicate in human cerebral organoids

研究人员用成熟CerOrg（含神经元、GFAP⁺星形胶质细胞、CD68⁺小胶质细胞、NES⁺神经祖细胞）进行感染实验。EBOV暴露后>90%类器官发生生产性感染并持续释放感染性病毒粒子达120天，病毒复制2周内达峰后维持平台期；EBOV RNA持续上升且病毒粒子/病毒RNA比值在15天后下降。相比之下LASV在7天后滴度下降并于48天内完全停止释放。rgEBOV-GFP和rgRESTV-GFP及野生型SUDV、RESTV、MARV均能在CerOrg建立持续感染。随感染时间延长，5′cb-DVG水平升高且经TEM证实存在缺陷干扰颗粒(DIP)，表明丝状病毒在脑类器官中持续复制并伴随DVG积累。

Ebola virus infects neurons and astrocytes, and recruits and infects microglia

免疫荧光染色显示EBOV NP最早于感染后第6天出现在RBFOX3⁺/MAP2⁺成熟神经元中并持续至120天；GFAP⁺星形胶质细胞自48–120天可检出NP；CD68⁺小胶质细胞自15–120天被感染且感染灶见小胶质细胞募集。少突胶质细胞在15天也被感染。电镜证实细胞质内核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein, RNP)及芽生病毒粒子。SH-SY5Y分化神经元中也确认EBOV持续感染，表明神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞及少突胶质细胞均可支持EBOV在CNS中的感染与持续。

Innate immune responses fail to control Ebola virus replication during persistent infection

细胞因子检测显示EBOV持续感染组（尤其48–120天）上清促炎介质（CCL2、CX3CL1、IL6、IL18、sTREM1、TNF、VSNL1等）水平显著高于未暴露组和LASV组，早期(≤48天)伴有代偿性抗炎因子(TGFB、NGF、BDNF)释放；LASV感染则引起早期较强但随病毒清除而消退的炎症反应。表明EBOV持续复制伴随进行性CNS样炎症反应且固有免疫未能清除病毒。

Ebola virus uses budding and cell-to-cell transmission routes during persistent infection

透射电镜及免疫荧光显示EBOV除经质膜出芽释放细胞外，还通过肌动蛋白(Actin)介导的长距离细胞连接器（隧道纳米管样结构）进行糖蛋白(GP_1,2)和NP的细胞间传播，在持续感染的小胶质细胞、星形胶质细胞及CerOrg的星形胶质细胞连接束和神经元融合部位均观察到此现象，提示细胞间传播是EBOV在CNS中逃避免疫清除并维持持续感染的机制之一。

Ebola virus evolves into subvariants in persistently infected human cerebral organoids

对持续感染微胶细胞和CerOrg上清EBOV基因组深度测序发现：长期传代微胶细胞中出现频率>60%的非同义单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant, SNV)，集中于NP、GP、VP30、VP24、L基因，VP35和VP40无变异。CerOrg 120天上清分离的EBOV亚变异株同样富集NP(7处)、GP(7处)、VP30(6处)、L(7处)的非同义SNV，VP35仅1处，VP40无。功能验证所有亚变异株仍可在CerOrg建立持续感染但在2D细胞中复制能力各异；相关性分析提示特定NP(L P401L)和NP(E590G) SNV与CerOrg中复制能力相关，部分VP30、GP、VP24 SNV可能影响VP30–NP互作、中和抗体结合及STAT1核输入抑制功能。

讨论与结论翻译

研究人员指出EBOV在CNS中的持续感染与神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞及少突胶质细胞的持续感染及小胶质细胞募集相关，并伴随病毒出芽和细胞间传播。细胞间传播可能协助病毒逃逸抗体中和。与小胶质细胞不同，星形胶质细胞不启动强效IFN-I响应但仍支持持续复制。EBOV在脑类器官中演化出基因组亚变异株及5′cb-DVG/DIP，VP40、VP35和VP24相对保守可能反映其对维持病毒聚合酶活性和拮抗宿主IFN响应的必要性。LASV无法在CerOrg建立生产性持续感染，提示该CNS持续机制在丝状病毒中保守。该人脑类器官模型重现了EBOV在免疫豁免组织中生产性持续感染的核心特征，为未来研究清除策略及干预靶点提供了平台。局限性包括类器官无血管及适应性免疫细胞、内部缺氧坏死区及细胞类型定量受限，需在含T细胞/B细胞及血脑屏障的进阶类器官中进一步探究适应性免疫与持续感染的关系。