《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Automated high-throughput Raman detection of fluidic samples: measurement setup and methods preventing air bubble interference
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拉曼光谱（Raman spectroscopy）已被广泛认为是一种在生物制药下游处理（downstream processing）中具有高潜力的分析工具，并且流式细胞检测池（flow cell）已被建议用于原位（in situ）或在线（in-line）拉曼光谱
拉曼光谱（Raman spectroscopy）已被广泛认为是一种在生物制药下游处理（downstream processing）中具有高潜力的分析工具，并且流式细胞检测池（flow cell）已被建议用于原位（in situ）或在线（in-line）拉曼光谱测量，至少用于开发规模的过程。然而，对于无法通过在线监测系统访问的样品，特别是微升至毫升范围内的低体积样品，仍然需要拉曼分析。本文提出了一种新装置，能够实现对低进样体积（300 μL）液体样品的自动化拉曼测量。一个设计的适配器将Tornado Micro Flow Cell与Tecan液体处理系统（liquid handling system）连接，允许直接样品输送。这项工作重点研究在该装置上实施的一系列方法，以解决气泡（air bubbles）问题，气泡在测量过程中会显著干扰拉曼信号质量。这些方法包括调整停留时间（residence time）、三步冲洗/清洁方法（three-step purging/cleaning method），并结合垂直向上流动（vertical and upflow）的流式细胞检测池方向。一系列实验证明了这些方法在减少气泡和提高光谱稳健性（spectral robustness）方面的有效性。所提出的装置和方法能够实现小进样体积和高质量光谱数据的流体样品的自动化高通量拉曼检测。
研究背景方面，拉曼光谱（Raman spectroscopy）作为过程分析技术（Process Analytical Technology，PAT）在生物制药下游处理（downstream processing，DSP）实时监测中具有巨大潜力，已有研究利用流式细胞检测池（flow cell）或浸入式探针实现在线测量，但模型校准通常依赖离线预设计样品的测量，所需样品数量可达数十至数百个，制备和测量成为瓶颈。为解决该问题，研究人员曾尝试将拉曼光谱与Tecan液体处理站集成，但手工连接器可重复性差且易引入气泡，导致光谱波动。为此，本研究通过3D打印适配器优化流体连接，并开发了防止气泡干扰的方法，旨在实现自动化高通量拉曼检测。研究结论表明，优化停留时间（residence time）、三步冲洗/清洁方法（three-step purging/cleaning method）以及垂直向上流动（vertical upflow）的流式细胞检测池方向能有效消除气泡，提升光谱稳健性。该工作发表于《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。
主要关键技术方法包括：采用自行设计的3D打印适配器连接Tecan针头与Tornado Micro Flow Cell，实现标准化可重复的流体连接；通过调整进样针尖端的停留时间控制线性流速以抑制气泡形成；结合垂直向上流动方向，使气泡易于排出；开发包含两次冲洗和一次清洗的三步冲洗/清洁方法（三步法），用于去除进气后的气泡残留。实验中使用纯净水和空气作为测试样本，未提及特定样本队列来源。
研究结果分为两个小节：
1. **通过三步法有效去除气泡**：研究通过100次重复实验，比较垂直向上流动与水平流动下三步法的效果。在垂直向上流动条件下，进气阶段光谱基线显著下降（如蓝宝石峰从24000计数降至12000计数），但三步法冲洗后水谱基线稳定，变异系数（Coefficient of Variation，CV）仅为0.68%~1.74%，表明高可靠性和可重复性；而水平流动下冲洗后光谱波动剧烈（CV达18.6%~91.2%），部分实验完全失败。结论：三步法在垂直向上流向下能有效且稳健地去除气泡。
2. **进样针尖端停留时间的影响**：研究对300次随机进样实验设定10个不同停留时间（0.5~6.0 s），各30个重复。结果发现，停留时间低于1.0 s时气泡干扰严重（光谱基线大幅下降），CV值急剧升高；停留时间在1.0~2.0 s时CV趋于4%~6%；停留时间超过2.0 s后，CV降至0.8%以下，与成功冲洗阶段的CV值相当。结论：停留时间大于2.0 s可有效防止气泡形成，研究选用3.0 s作为标准参数；水平流动下无论停留时间如何均无法实现稳健测量。
讨论部分总结认为，相比前人手工连接器（易磨损、可重复性差），本研究的3D打印适配器可实现标准化生产，且经过2000次针头注射无需更换耗材，自动化检测时间从43小时（169样品）缩短至6小时（100样品）。该装置适用于2 mL管、15/50 mL离心管及96孔板样品，可应用于过程中间体监测、冻融研究、稳定性研究和模型校准样品测量，并将所需样品体积降至300 μL，相比前人在线方法减少98%的物料成本。结论部分翻译：本研究报告了一种自动化装置，通过3D打印适配器将拉曼流式细胞检测池与液体处理站连接，实现无气泡进样和稳健拉曼测量。为解决气泡问题，研究人员开发了三步冲洗/清洁方法作为标准流程，实验证明该方法能在50秒内有效去除有意引入的气泡。此外，进样针尖端短停留时间（尤其低于1 s）易引入气泡，而大于2 s的停留时间可靠防止气泡形成。上述方法仅在流式细胞检测池垂直向上流动方向下成功。研究表明，优化停留时间、冲洗方法和流式细胞检测池方向是确保液体处理站上无气泡自动化拉曼测量、获得高光谱质量与准确性的关键要素。这些进展标志着拉曼光谱作为过程分析技术（PAT）在下游处理开发与制造中迈出了重要一步。
