胶囊相微萃取（Capsule Phase Microextraction, CPME）结合高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC–DAD）测定人尿中四种四环素类抗生素方法学的建立

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Development of a capsule phase microextraction (CPME) protocol for the determination of four tetracyclines in human urine prior to HPLC–DAD analysis

本研究建立了一种新型、绿色的胶囊相微萃取（Capsule Phase Microextraction, CPME）前处理方法，并结合高效液相色谱-二极管阵列检测器（High Performance Liquid Chromatography coupled to Diode Array Detector, HPLC–DAD）选择性测定人尿液中四种四环素类抗生素——土霉素（Oxytetracycline, OTC）、四环素（Tetracycline, TC）、金霉素（Chlortetracycline, CTC）及强力霉素（Doxycycline, DC）。在测试的五种CPME装置中，溶胶-凝胶C18（sol–gel C18）胶囊表现出最高的萃取效率。研究人员采用单因素法（One-Factor-At-a-Time, OFAT）优化影响样品制备的主要因素，确定最佳样品体积为4 mL。方法经线性、选择性、准确度、灵敏度及精密度验证：四种分析物在0.03–0.50 μg/mL浓度范围内呈良好线性（R2> 0.998），检出限（Limit of Detection, LOD）和定量限（Limit of Quantitation, LOQ）分别为9 ng/mL和30 ng/mL；日内与日间相对标准偏差（Relative Standard Deviation, %RSD）分别低于6.7%和8.7%；加标回收率为93.9%–110.8%（日内）和90.8%–112.4%（日间）。研究人员采用ComplexMoGAPI（Complex Modified Green Analytical Procedure Index）、BAGI（Blue Applicability Grade Index）、VIGI（Violet Innovative Grade Index）及RAPI（Red Analytical Performance Index）评估了方法的绿色性、实用性、创新性与分析性能。综上所述，所建立的CPME-HPLC–DAD方案为一种简便、环保且高可靠性的人尿中四种四环素选择性定量分析方法。

论文解读：人尿中四种四环素类的胶囊相微萃取-高效液相色谱法测定及绿色评价

本研究发表于《Analytical and Bioanalytical Chemistry》。四环素类（Tetracyclines, TCs）抗生素因广谱抗菌活性被广泛应用于人与兽医学，其进入人体后70%以上以原形或代谢物经尿液排泄，因此尿液是治疗药物监测及环境耐药基因溯源的重要生物基质。然而尿液含蛋白、盐类及内源性代谢物，传统液液萃取（Liquid-Liquid Extraction, LLE）与固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）存在有机溶剂耗量大、步骤繁琐、易污染色谱柱等局限，不符合绿色分析化学（Green Analytical Chemistry, GAC）原则。微型化样品前处理技术如胶囊相微萃取（Capsule Phase Microextraction, CPME）具备低溶剂消耗、集混合/过滤/萃取于一体、可重复使用等优势，但目前报道多针对单一四环素（如仅测多西环素）。为此，研究人员开发并验证了基于溶胶-凝胶C₁₈CPME结合HPLC–DAD同时测定人尿中OTC、TC、CTC、DC的新方法，并用多维度指标评价其绿色性、创新性及分析性能。

主要关键技术方法

研究人员以人工模拟尿液为替代基质，筛选五种溶胶-凝胶包埋CPME胶囊（CW 20M、C₁₈、PDMS、PEG 300、PDMDPS），经单因素试验（One-Factor-At-a-Time, OFAT）优化胶囊尺寸、样品体积、离子强度、搅拌速率、洗脱溶剂种类/体积/时间、吸附时间等参数；采用基质匹配校准曲线进行方法验证（线性、LOD、LOQ、选择性、准确度以加标回收率表示、精密度以RSD表示、稳定性、胶囊复用性）；以ComplexMoGAPI、BAGI、VIGI、RAPI四大量化工具综合评估方法属性；并将优化方法应用于三名健康志愿者真实尿样。

Results and discussion

Optimization of CPME conditions——CPME条件优化

经五种溶胶-凝胶吸附剂比对，sol–gel C₁₈胶囊因疏水作用对两性离子态四环素类吸附最强，绝对回收率为OTC 33%、TC 53%、CTC 64%、DC 49%，被选定。1.5 cm长胶囊较1 cm提供更大比表面积与更高回收率；样品体积4 mL时萃取效率最高，超过5 mL因吸附饱和下降；加盐（NaCl 0–20% w/v）产生负面效应故不调节离子强度；提取与洗脱步骤最适搅拌速率分别为350 rpm与500 rpm；甲醇（MeOH）因可形成氢键洗脱力强于乙腈（Acetonitrile, ACN）及二者混合液，选为洗脱溶剂；1 mL MeOH可达与2 mL相当回收率且富集因子更高；洗脱时间15 min保证OTC完全解吸，吸附平衡达30 min。人工尿样pH调至6.5使TCs以两性离子形式存在，利于C₁₈吸附且避免酸化致降解。

CPME-HPLC–DAD method validation——CPME-HPLC–DAD方法验证

基质匹配校准曲线在0.03–0.50 μg/mL线性良好（R²> 0.998），LOD = 9 ng/mL，LOQ = 30 ng/mL。空白人工尿及真人尿色谱图在目标物保留时间处无干扰峰，峰纯度检验合格，证明选择性好。三个浓度水平（0.13、0.25、0.50 μg/mL）加标回收率日内93.9%–110.8%、日间90.8%–112.4%，符合验证接受限；日内RSD < 6.7%，日间RSD < 8.7%。sol–gel C₁₈胶囊可重复使用该装置达12次无明显性能衰减。四环素类在模拟尿中室温短期稳定、处理后进样室8 h稳定、?20 °C冻融三循环稳定、4 °C存一周与?20 °C存两周稳定。

Evaluation of sample preparation greenness and practicality——样品制备绿色度与实用性评价

ComplexMoGAPI得分81/100，表明前处理及整体流程环境友好；VIGI创新指数75/100，反映微型化、少溶剂及多组分同时测定具较高新颖性；RAPI分析性能指数62.5/100；BAGI实用性指数60/100（达最低实用阈值），受需预浓缩及样品量略大限制，但整体满足常规实验室应用。

Application to real human urine samples——实际人尿样品应用

三名未服用四环素类药物的健康志愿者尿样中四种TCs均未检出，证实方法可排除内源性基质干扰。

Comparison with other studies——与其他研究比较

相较已报道仅测单一多西环素的CPME法，本工作实现四组分同时测定且LOQ（30 ng/mL）更低；与传统SPE、QuEChERS及分散微固相萃取（Dispersive Micro Solid-Phase Extraction, DMSPE）相比，所需样品体积小（4 mL）、RSD更低、富集因子（Concentration Factor, CF）= 40，准确度相当，更符合绿色化学原则。

Conclusions（结论部分翻译）

本研究建立并验证了基于胶囊相微萃取（CPME）结合高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC–DAD）简便高效测定人尿中四种四环素类抗生素的方案。溶胶-凝胶C₁₈包埋微萃取介质被证实为四种TCs最有效的CPME吸附装置。经验证的CPME-HPLC–DAD方法展现出满意的分析性能，包括良好线性、低检出限、高灵敏度、强精密度与回收率。sol–gel C₁₈涂层CPME装置在完成至少连续12次萃取-解吸循环后仍保持显著萃取性能。最终，该微萃取方案成功应用于实际人尿样品中四环素类的测定，可作为监测此类药物的可靠分析工具。CPME-HPLC–DAD方法因其简便性、成本效益及契合绿色分析化学（GAC）原则，可被视为传统样品前处理方法的可靠替代方案。