一种用于调控番茄青枯病的pH响应型双网络水凝胶

《Nature Communications》：A pH-responsive double network hydrogel for control of tomato bacterial wilt

　　

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是导致青枯病的主要植物病原体，其暴发时间难以预测，阻碍了及时检测与有效防控。研究人员报道了一种双重pH响应多功能双网络（double network，DN）水凝胶的设计、制备及田间应用，用于高效且可持续地防控青枯病。其初级网络由羧基化琼脂糖构成，在酸性条件（pH ≤ 5）下通过羧基对Zn²⁺的螯合作用减弱而发生松弛，从而释放农药中生菌素与Zn²⁺；其二级网络为L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，Phe）/Zn²⁺网络，在酸性条件下解组装，进一步提供具有生物活性的组分（Phe与Zn²⁺）。这种双触发释放实现了协同抗菌效应，增强了植物生长，并激活了植物抗病通路。通过简便的根部施用即可对植株提供最长14天的保护，田间试验证明其病害防控效果可持续长达30天，并显著维持番茄产量。该研究提出了一种用于管理青枯病的可持续且有效的体系，并凸显了智能水凝胶在作物保护中的应用潜力。

《Nature Communications》发表的这项研究聚焦于番茄青枯病这一全球重要土传病害的精准防控难题。青枯病由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，宿主范围广、致病性强、暴发快，一旦定殖通常难以逆转，给番茄、马铃薯、辣椒等茄科作物造成严重减产。现有防控手段总体效果有限，尤其是传统农用抗生素或杀菌剂不仅易受土壤淋洗、扩散和环境条件影响，还可能诱导病原菌抗性、扰动土壤生态系统并增加环境风险。既往研究表明，青枯病重发田块通常伴随更低的土壤pH，酸化环境既有利于病原菌繁殖，也与病害加剧密切相关。因此，围绕“酸性病土”这一关键生态线索，发展能够在特定酸性条件下精准释放活性成分、兼具长效防控与环境友好特征的新型递送体系，具有明确的理论意义与农业应用价值。

研究人员据此构建了一种双重pH响应双网络（double network，DN）水凝胶体系，核心目的是在青枯病高风险酸性土壤中实现中生菌素、Zn²⁺和L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，Phe）的按需释放。研究以羧甲基化琼脂糖（carboxymethylated agarose，CMA）或柠檬酸化琼脂糖（citrate agarose，CTA）为第一网络骨架，并利用Zn²⁺与Phe原位构筑第二超分子网络。该体系在酸性条件下，一方面羧基与Zn²⁺配位减弱导致主网络松弛，另一方面Phe-Zn²⁺组装解离，使农药和生物活性组分同步加速释放。论文最终证明，这一材料不仅能够直接抑制病原菌、减少根际侵染，而且能够促进植株生长并诱导系统抗性（systemic resistance），在盆栽和田间条件下都展现出优异而持久的防病效果。其中，CTA DN凝胶在力学性能、酸响应释放和诱导抗性方面整体优于CMA DN凝胶，更适合农业应用。

研究所用关键技术方法可概括为以下几类。其一，材料构建与表征：通过化学修饰制备CMA和CTA，并采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）、zeta电位、冷冻扫描电镜（cryo-SEM）、透射电镜（TEM）及流变学分析验证双网络结构、凝胶化动力学和力学性质。其二，功能评价：利用高效液相色谱（HPLC）和紫外-可见分光光度法检测中生菌素、Phe和Zn²⁺在不同pH下的释放行为，并通过体外抑菌、活/死菌染色和电镜观察评价抗菌效应。其三，生物学与应用验证：在酸性土壤盆栽体系和重庆连续种植、自然发病的番茄田间开展防效试验，结合GFP标记病菌示踪、qPCR、RNA测序（RNA-seq）、代谢组/激素检测中的水杨酸（salicylic acid，SA）定量以及土壤宏基因组测序，系统评估其防病、促生、安全性和生态影响。

**Characterization of CMA, CTA, and CMA/CTA DN gels**
研究人员首先对两类羧基化琼脂糖进行了构建与鉴定。FTIR显示CMA和CTA在约1730 cm^?1处出现羰基特征峰，zeta电位下降，¹H NMR与¹³C NMR均出现相应新峰，证明羧甲基和柠檬酸基团已成功引入琼脂糖。随后，Zn²⁺与CMA或CTA快速形成凝胶，且加入Phe后可在水相条件下进一步生成双网络凝胶。cryo-SEM显示CMA和CTA呈蜂窝状多孔结构，Phe-Zn²⁺呈杆状组装体，而在DN凝胶中，杆状结构均匀嵌入连续琼脂糖基质，直接支持互穿双网络的形成。流变学结果表明，Zn²⁺显著缩短凝胶化时间并提高强度，Phe进一步将凝胶机械强度提升5–10倍；其中CTA-Zn²⁺体系因羧基密度更高、孔径更小而表现出更高的力学强度。该部分结果说明，材料构建方案可行，且CTA体系在结构致密性和机械性能方面具有优势。

**Acid-responsive and drug release of CMA/CTA DN gels**
在功能机制方面，研究人员验证了材料的双重酸响应特性。理论上，酸性环境会使CMA/CTA链上羧基质子化，削弱与Zn²⁺的配位；同时Phe的羧基质子化也会破坏Phe-Zn²⁺自组装网络。实验中，Phe-Zn²⁺凝胶在强酸中迅速解体，在低pH条件下也表现出明显溶解趋势。以罗丹明B示踪的DN凝胶在pH 1、3和5条件下均较pH 7释放更快。TEM和SEM进一步显示，酸处理后DN凝胶孔径增大，Phe-Zn²⁺杆状结构消失，说明双网络确实在酸性环境中被破坏。药物释放实验表明，pH 3和pH 5条件下，Phe、中生菌素和Zn²⁺的释放显著高于pH 7；在pH 3下，中生菌素和Zn²⁺释放率均超过75%，Phe释放率超过50%。CTA DN凝胶对Phe和Zn²⁺的释放高于CMA DN凝胶，说明其酸敏感性更强。该部分明确证明，双网络设计使材料能够响应青枯病相关酸性土壤，实现定向、增强和持续的活性物释放。

**pH-responsive antibacterial activity in vitro**
在体外抑菌评价中，研究人员先确定Zn²⁺和中生菌素对青枯雷尔氏菌的最低有效抑制水平，发现二者在较低浓度下即具有明显抑菌作用。随后，将DN凝胶在不同pH条件下浸提所得释放液用于抑菌。结果显示，来自pH 3和pH 5条件的CMA/CTA DN凝胶释放液均可完全抑制病菌增殖，并在平板实验中实现100%抑制率，显著优于Zn²⁺、中生菌素单独处理及二者混合对照。活/死菌荧光染色显示，DN凝胶处理组细菌几乎全部呈死亡信号；SEM观察到细胞表面破裂、塌陷和异常聚集，表明细胞结构遭受严重损伤。该部分结果说明，酸性条件下增强释放所带来的Zn²⁺与中生菌素协同作用，是材料强效抑菌的重要基础。

**Pot experiments and root bacterial infection visualization**
在盆栽试验中，研究人员首先用5(6)-羧基荧光素替代农药示踪，发现DN凝胶在pH 5土壤中释放的荧光分子能够被番茄根系吸收并运输至近根茎部，证明其释放物可到达病原菌侵染关键部位。随后，装载中生菌素的DN凝胶用于番茄根部处理并接种病菌。7天时，对照组和单独Zn²⁺或农药组已出现萎蔫，而DN凝胶组无明显症状；14天时，对照及常规处理组病情显著加重，而DN凝胶组仍基本无症状，仅少数下位叶轻度萎蔫，病情指数远低于各对照组。进一步利用GFP标记的青枯雷尔氏菌观察根部侵染，发现DN凝胶显著降低根横切面和纵切面的GFP荧光信号，qPCR也显示根部病菌负荷几乎不可检测。该部分表明，DN凝胶不仅能在土壤中抑菌，还能有效阻断病菌对根系的侵入和定殖，从而实质性降低青枯病发生。

**Biological safety and growth-promoting effects of the CMA/CTA DN gels**
论文还评估了材料的促生和安全性。由于Zn²⁺和Phe均为植物生长相关营养因子，研究人员考察了DN凝胶释放液对番茄生长的影响。结果显示，处理后植株根、茎、叶中Zn含量增加，且酸性释放条件下更高；持续处理3周后，番茄株高、株幅、根长、鲜重和干重均显著提升。与此同时，花粉萌发率均超过80%，第一穗坐果率均高于70%，说明其不影响生殖表现。在生物安全方面，番茄、玉米和水稻种子萌发率在各处理下接近100%，且酸性条件释放液还能促进幼苗生长。蚯蚓土壤暴露试验中，处理组生存率超过85%，活力良好。该部分结果说明，DN凝胶兼具较高生物相容性与促生潜力，适合土壤环境施用。

**Field experiment**
田间试验是本研究的重要应用验证环节。研究人员于2024和2025年在重庆连续种植5年的番茄重病田中开展自然发病试验，并在病害高发前进行一次性施用。结果显示，处理两周后，CMA和CTA DN凝胶组的发病率已明显低于清水和农药组；随着第三、四、五周病程推进，凝胶组始终维持更低的发病率和病情指数。5周后，清水组和农药组发病率分别达81.2%和63.2%，而CMA与CTA DN凝胶组仅为35.9%和28.2%；病情指数亦显著更低。与此同时，凝胶组植株长势更好、果实品质更优、产量更高。土壤淋洗实验进一步表明，游离农药在酸性土壤中前期浓度高但迅速流失，而DN凝胶可在保持较高初始释放的同时维持更长时间的农药滞留。结合土壤中约1个月的可见降解过程，说明该材料能够在实际土壤中实现定位、持续、缓释的防病作用。这一结果直接支持作者提出的农业应用价值：单次根部施用即可提供长效病害抑制并减少农药流失。

**Metagenomic assessment of the CMA/CTA DN gels on soil microbiomes**
为评估长期生态影响，研究人员在施用约7个月后对田间土壤进行宏基因组测序。Beta多样性分析显示处理组与对照组微生物群落组成存在显著分离，提示材料会引起群落重塑；但测序深度、基因丰富度、组装质量及优势菌门构成总体稳定，没有出现明显失衡。KEGG功能分析显示核心代谢通路基本稳定，虽有部分通路达到名义显著性，但经假发现率（FDR）校正后不再显著，表明群落变化并未转化为关键生态功能损伤。抗生素抗性基因（ARG）注释结果显示，处理组总ARG丰度低于对照组，且主要耐药类别未见协同富集；移动遗传元件（mobile genetic elements，MGEs）丰度也无显著上升，未见ARG与MGE同步扩张。该部分结果支持作者关于生态友好性的判断：该体系引发的是有限且可接受的群落结构调整，而非破坏性生态扰动。

**CMA/CTA DN gels boost tomato resistance via defense pathways**
除直接抑菌外，研究人员还证明DN凝胶可激活植物系统抗性。无农药版本的CMA/CTA DN凝胶处理后，番茄叶片中水杨酸（SA）在第3天和第5天显著升高，第7天恢复至接近基线，说明其可短期诱导免疫信号。RNA-seq显示，CMA DN凝胶处理上调239个基因、下调103个基因；CTA DN凝胶处理上调139个基因、下调165个基因。差异基因主要富集于苯丙烷生物合成、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、植物-病原体互作以及植物激素信号转导等免疫相关途径。qPCR验证支持转录组结果可靠。热图分析进一步显示，钙信号和乙烯（ethylene，ET）相关防御基因被重新编程，其中CTA DN凝胶对乙烯通路相关基因诱导更强。根部施用无农药DN凝胶后，再对叶片进行病菌接种，凝胶组叶片坏死斑面积明显减小，证实其诱导的是可在远端组织表现的系统抗性。Zn²⁺积累检测表明，CTA DN凝胶处理植株Zn水平高于CMA组，这与其更强的诱导抗病能力一致。该部分结果表明，DN凝胶通过释放Zn²⁺和Phe，不仅改善根际防御，还可系统性增强植株免疫状态。

综合全文，研究人员围绕青枯病偏酸性土壤环境这一关键病理生态特征，构建了兼具“病土识别—精准释放—持续抑菌—诱导抗性—促生增产”多重功能的一体化双网络水凝胶平台。该材料以天然来源或相对环境友好的组分为基础，通过Zn²⁺统一驱动两重网络形成，结构设计简洁，应用方式直接，能够在病害发生的关键时空位置释放中生菌素、Zn²⁺和Phe，从而兼顾病原抑制、药效延长、植物营养补给与免疫激活。与传统直接施药相比，这一体系在土壤中的保持性和利用效率明显提高，也减少了农药快速淋洗造成的效率损失和环境压力。特别是CTA DN凝胶因制备过程更简化、无需有机溶剂、机械性能更强、酸响应更敏感、促抗效果更优，显示出更高的实际推广潜力。

研究结论部分可译为：本研究成功开发了一种多功能水凝胶，采用简便策略，以Zn²⁺作为交联剂促进CMA或CTA聚合物与Phe组装。该水凝胶具有双重pH响应行为，能够特异性响应青枯病特征性的酸性条件（pH < 5）。这一环境信号可触发所包载农药、Zn²⁺和Phe的可控且持续释放，从而实现对青枯病的精准防治，并同时激活植株系统抗性，增强植株生长和产量。值得注意的是，在农业生产中单次施用该类水凝胶即可实现超过1个月的持续性青枯病抑制，显著降低发病率并保障作物稳产。该研究为青枯病精准管理提供了创新方案，具有提升农药利用效率、降低生产成本并减轻不当施药环境影响的显著潜力。进一步而言，CTA DN凝胶相较CMA DN凝胶更适用于农业应用。