《Microorganisms》：Global Probiotic Markets Meet Synthetic Biology: Translational Challenges and Escherichia coli Nissle 1917 as a Model Chassis
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全球益生菌市场正迅速扩张，这主要得益于消费者对肠道健康、预防性护理以及基于微生物组干预策略的需求日益增长。然而，商业增长与经临床验证、机制驱动的产品数量有限之间存在显著反差，凸显了市场扩张、科学证据与治疗转化之间的 persistent 差距。当前市售益生菌仍
全球益生菌市场正迅速扩张，这主要得益于消费者对肠道健康、预防性护理以及基于微生物组干预策略的需求日益增长。然而，商业增长与经临床验证、机制驱动的产品数量有限之间存在显著反差，凸显了市场扩张、科学证据与治疗转化之间的 persistent 差距。当前市售益生菌仍以传统属种为主导，包括乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、酵母菌属（Saccharomyces）及链球菌属（Streptococcus），而活菌治疗产品（Live Biotherapeutic Products, LBPs）仍然稀缺。合成生物学正通过将益生菌从经验性筛选的菌株转变为可感知疾病相关信号并产生确定性治疗输出的可编程微生物平台，来应对这一差距。大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917, EcN）因其长期的人体使用历史、安全性记录、遗传可操作性、瞬时肠道定植能力及可规模化培养等优势，为工程化益生菌提供了宝贵的模式底盘。作为一种罕见的革兰氏阴性益生菌，EcN天然产生外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs），这些囊泡支持宿主互作、免疫调节及治疗性货物递送。本综述将益生菌市场扩张与活菌治疗开发相关联，并以EcN为例讨论新兴的工程策略、治疗机遇及尚存的转化障碍。
## 1 引言
全球益生菌市场规模在2025年约为700-1140亿美元，预计未来十年将达到1300-3000亿美元。然而，市场快速增长的背后，产品的临床与机制成熟度却不均衡。当前市场仍以乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母（如布拉氏酵母菌，Saccharomyces boulardii）及芽孢杆菌属等传统菌株为主导，许多商业产品定位于广义健康宣称而非明确定义的作用机制或严格验证的临床结局。根据国际益生菌与益生元科学协会（International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics, ISAPP）的共识定义，益生菌是指能够对宿主产生已证实健康效益的活体微生物，强调菌株鉴定、循证功能及临床验证的必要性。然而，许多市售益生菌仍缺乏一致的疗效、机制清晰度及适应症特异性验证，揭示了市场增长、科学证据与治疗转化之间的 persistent 差距。合成生物学的进展正通过将益生菌转化为具有定义性和可控功能的可编程微生物平台来应对这一差距。工程化微生物能够感知宿主或疾病相关信号，并通过合成回路产生确定的治疗输出，如代谢物、蛋白质、免疫调节剂或外膜囊泡（OMVs）。在此新兴领域中，大肠杆菌Nissle 1917（EcN）因其长期的人体使用史、明确的安全性特征、强大的遗传可操作性、瞬时肠道定植能力及可规模化培养等优势，提供了评估工程化益生菌机遇与挑战的宝贵模式底盘。作为罕见的革兰氏阴性益生菌，EcN还具有区别于许多传统益生菌宿主的生物学特征，包括特殊的表面结构、多重铁摄取系统以及天然OMV产生能力，这些特性支持其肠道适应性、宿主互作、免疫调节及治疗货物递送。本综述将全球益生菌市场的扩展与新一代活菌治疗开发的转化挑战相联系，首先考察当前市场趋势及临床验证与机制理解方面的差距，随后以EcN为模式底盘讨论其作为可编程微生物平台的机遇，最后强调转化与商业化面临的主要障碍，包括技术挑战、监管要求及公众接受度。
## 2 全球益生菌市场格局
### 2.1 益生菌产品市场
全球益生菌市场稳步增长，消费者对肠道微生物组及其在整体健康中作用的认识不断提高。产品形式显著多样化，涵盖传统发酵乳制品（如酸奶和开菲尔）、非乳饮料、膳食补充剂（胶囊、片剂和粉剂），以及零食棒、强化植物基食品和功能性饮料等新兴形式。从监管和应用角度，益生菌产品可依据其宣称用途分为三类：（i）无健康宣称或仅定位一般健康/肠道健康的产品；（ii）具有特定健康宣称、针对明确功能效益（如免疫支持或降低腹泻风险）的产品；以及（iii）为临床验证的疾病治疗或预防而开发的活菌治疗产品（LBPs）。实践中，大多数商业益生菌作为食品或膳食补充剂销售，在监管层面通常依据美国"公认安全"（Generally Recognized as Safe, GRAS）或欧盟"安全资格推定"（Qualified Presumption of Safety, QPS）等基线安全性认定，配合菌株鉴定及活力、纯度和稳定性等质量控制措施。相比之下，LBP作为面向药物导向的活体微生物治疗类别，需要最严格的验证。这种商业规模与科学严谨性之间的错配凸显了领域面临的重大挑战。
### 2.2 益生菌原料市场
产品层面的多样化与上游需求紧密关联，推动全球益生菌原料市场同步增长。该市场总收入预计从2022年约23亿美元增长至2030年超过41亿美元，复合年增长率（Compound Annual Growth Rate, CAGR）在不同健康效益类别中介于约6.9%-8.2%。从产业视角，益生菌已拓展至免疫支持、女性健康、代谢调节乃至通过肠-脑轴（gut-brain axis）的神经功能等更广泛的健康效益类别。肠道健康仍是收入主导驱动力，但市场正日益多元化，运动营养、脑健康、代谢健康和内在美容等新兴细分市场增长显著。2023年的市场组成显示，非产孢细菌占据约24.5亿美元的绝对优势份额，其中乳杆菌属（15.6亿美元）和双歧杆菌属（7.2亿美元）占绝大多数，而酵母基益生菌（主要为酿酒酵母属，约2.9亿美元）和产孢细菌如芽孢杆菌属（约1.2亿美元）仅占较小份额。这种分布反映了对少数已确立属种的过度依赖，凸显了当前产品中微生物多样性和功能创新的显著局限。
### 2.3 益生菌药物
除在食品和膳食补充剂中的广泛应用外，益生菌正日益被探索于医药应用领域。全球微生物组治疗市场2022年估值为9490万美元，预计至2030年达到10.668亿美元，CAGR高达35.3%，由研发合作扩展、新药开发和管线增长所驱动。然而，尽管市场快速扩张，DrugBank 6.0数据库中收录的益生菌物种仍十分有限，涵盖乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属和酵母菌属等。这些条目涵盖从非处方药（Over-the-Counter, OTC）、处方药、草药补充剂到已撤销或退市产品的多种审批状态。值得注意的是，仅少数益生菌具有明确的治疗适应症（如腹泻治疗、肠道菌群支持或阴道感染管理），许多仍被宽泛标注为"肠道健康"或缺乏精确的机制描述，反映了临床验证和监管定位的不一致性。
## 3 研究强度与临床转化差距
受合成生物学、高通量测序和系统级代谢分析进展的推动，益生菌正从经验性筛选菌株向理性设计的微生物治疗转变。这一转变将益生菌研究的功能范围从一般肠道健康扩展至免疫调节、代谢调控和疾病靶向干预等机制导向应用。然而，研究活动的增加尚未按比例转化为经临床验证的产品。
传统益生菌属种（如乳杆菌属、双歧杆菌属和酿酒酵母属）仍在商业产品、科学发表和临床研究中占据主导，这主要归因于其长期使用历史、监管熟悉度和已确立的安全性特征。相比之下，LBP（包括下一代益生菌、粪菌产品、理性定义细菌菌群、部位特异性单菌株和工程化益生菌）代表了规模较小但快速兴起的类别，具有更高的机制特异性和更强的治疗意图。若干LBP类别已展现临床潜力：粪菌产品如REBYOTA和VOWST已获得预防复发性艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染的监管批准；理性定义细菌菌群如VE202和VE303正在针对复发性艰难梭菌感染、肝性脑病和炎症性肠病进行开发；部位特异性单菌株产品如 crispatus乳杆菌CTV-05（用于细菌性阴道病）和粘液玫瑰单胞菌（Roseomonas mucosa，用于特应性皮炎）展示了如何将定义微生物菌株匹配至特定宿主生态位；工程化益生菌如减毒鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和工程化EcN菌株（如SYNB1618和SYNB1934）进一步扩展了可编程治疗功能的概念。
尽管取得这些进展，成功的益生菌衍生治疗相对于学术研究的体量仍有限。EcN作为研究最密集的益生菌平台之一脱颖而出，反映其长期临床历史、良好记录的安全性、强大的遗传可操作性及合成生物学应用适用性。然而，临床试验格局呈现不同模式：临床试验仍集中在若干传统益生菌分类单元，特别是乳杆菌属和双歧杆菌属菌株，而EcN在相对较少试验中有所体现。这一差异凸显了核心转化挑战——EcN从研究和工程角度极具吸引力，但其临床成熟度仍低于许多传统益生菌属种。关键挑战不仅在于证明EcN可以被工程化，更在于证明工程化EcN能在人体中实现稳健、可重复且具有临床意义的结局。
## 4 EcN的生物学与工程特征
EcN是罕见的革兰氏阴性益生菌实例，而当前商业和临床使用的大多数益生菌属于革兰氏阳性属种。与常规革兰氏阳性益生菌相比，EcN具有革兰氏阴性包膜特异性特征，包括外膜、脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）、周质腔室以及产生OMV的能力，为宿主互作和治疗工程提供了额外界面。
EcN含有典型的革兰氏阴性包膜结构，包括外膜、周质空间和内膜，以及介导宿主互作、粘膜定植和病原体排除的多样化表面相关结构。其LPS（O6血清型）呈现不寻常的半粗糙表型，由于O-抗原聚合酶基因突变，O-抗原在第1个残基后被截断。这种改变的LPS结构导致血清敏感性，被认为限制全身致病性同时保留肠道适应性特征（包括粘膜定植和生物膜相关病原体抑制）。K5荚膜多糖通过促进上皮粘附和诱导趋化因子反应，支持局部免疫信号而不赋予致病性大肠杆菌相关的侵袭行为。H1血清型鞭毛提供运动性，使EcN能够穿越肠道粘液层并获取有利定植生态位，同时刺激上皮抗菌肽产生，强化粘膜屏障防御。EcN还表达多种菌毛粘附素，包括F1A、F1C和curli菌毛，介导与上皮细胞、粘液和细胞外基质成分的附着，促进微菌落形成、生物膜发育和长期肠道定植，同时支持对肠道病原体的竞争性排除。
作为革兰氏阴性益生菌，EcN天然分泌OMV，这些囊泡作为免疫调节囊泡和可工程化递送载体已被相对深入研究。这与大多数革兰氏阳性益生菌底盘形成对比——后者释放的细胞质膜衍生膜囊泡（Membrane Vesicles, MVs）的生物发生和货物装载机制尚较不清楚。天然EcN来源OMV能够与肠道上皮和免疫细胞互作，在结肠炎模型中显示抗炎活性，作为肠-脑介质穿越至脑部并通过外膜蛋白A（Outer Membrane Protein A, OmpA）介导的免疫调节缓解阿尔茨海默病病理，并作为治疗载体（如装载溶瘤病毒OH2的OMV增强肿瘤蓄积并改善前列腺癌治疗）。工程化EcN系统进一步扩展了这一平台，通过增强囊泡生产和货物递送，包括群体感应调控的动态遗传回路、自溶性肽聚糖水解酶策略以增加囊泡分泌，以及工程化高产EcN来源膜囊泡在炎症性肠病模型中的治疗功效。此外，基于零型分泌系统（Type Zero Secretion System, T0SS）的EcN平台通过实现酶装载OMV的原位生产，使治疗蛋白能够免受消化液破坏、通过胞吞转运穿越完整肠道上皮屏障、进入系统循环，并在高尿酸血症小鼠模型中实现优于直接蛋白分泌的治疗效果。
尽管临床前进展强劲，EcN-OMV治疗尚未获批，部分原因是与EcN底盘及其囊泡产品相关的安全考虑需要系统评估和缓解。这些关注的问题可通过理性底盘工程解决，如去除潜在有害基因组元件、减毒免疫刺激成分、控制囊泡生产以及应用严格纯化和质量控制。其注释良好的约5.05 Mb基因组及两个天然隐蔽质粒pMUT1和pMUT2提供了额外工程机遇：这些质粒已被系统改造为无选择标记表达载体，并进一步最小化以创建EcN的无抗生素表达系统。此外，多种基因组工程策略已建立，包括基于CRISPR-Cas9的质粒消除、无标记染色体整合和定制化先导编辑（prime editing），支持精确而稳定的底盘优化。
合成生物学和基因组工程的最新进展正将EcN定位为下一代治疗的高度可编程平台。基因组最小化日益被视为获得更可预测和高效细菌底盘的途径，因为精简基因组可提高稳定性、减少不必要的调控/代谢负担并释放生物合成能力。大肠杆菌建模研究表明，接近约40%建模基因的大规模基因组缩减可能可行，这已在MG1655来源的精简基因组菌株中实验证实。然而，EcN中尚未建立可比拟的大规模基因组缩减，因此EcN基因组最小化仍是有前景但需谨慎约束的策略，任何精简基因组EcN菌株必须经过实验验证以确保活力、安全性、定植能力和益生菌功能得以保留。精简后的EcN底盘可作为整合功能性合成回路的稳定背景，这些回路可设计为感知生理相关输入（如营养缺乏信号、疾病相关生物标志物或炎症线索）并将其转化为受控治疗输出的模块化遗传程序。通过将信号传感器、调控模块和治疗生产途径整合至染色体或pMUT1和pMUT2等天然质粒系统，工程化EcN可在肠道内实现情境依赖性响应。
## 5 挑战与未来方向
全球益生菌市场持续快速扩张，反映了消费者对肠道健康、预防性保健和可及生物干预的强劲需求。然而，当前大多数益生菌产品仍是具有广义健康宣称的传统配方，而非机制定义或临床验证的治疗。这一差距为新一代活菌治疗超越传统补充剂、转向具有明确疾病相关功能的可编程微生物产品创造了重要机遇。实现这一转变不仅需要改进微生物工程，还需要更强的疗效证据、标准化制造、适当的监管路径和更广泛的公众接受。
从技术角度，工程化活菌治疗仍面临若干重大挑战，包括遗传稳定性、回路负担、可预测治疗输出、菌株 containment、产品配方和可规模化制造。工程策略如染色体整合、基因组最小化、营养缺陷型安全保障、杀伤开关、调控表达系统和优化发酵可助解决这些问题。然而，技术可行性本身并不足够——核心转化挑战在于证明工程化微生物能在人体中产生稳健、可重复且具有临床意义的功能。
监管可能是商业化最大的障碍之一。工程化活菌治疗产品必须满足高于食品或膳食补充剂益生菌的标准，包括严格的安全性评估、制造一致性、遗传稳定性、环境 containment 和明确的疗效证据。这些要求对基因修饰生物体尤为重要，其中菌株设计、持久性、水平基因转移风险和环境释放必须仔细评估。EcN提供了这一路径前景与挑战的有用例证：其长期人体使用史、遗传可操作性和既往作为合成生物制剂的临床开发支持其转化潜力，但SYNB1934在III期研究中期分析显示不太可能达到主要疗效终点后终止（尽管无重大安全性或耐受性问题），凸显重要教训——安全性本身不足够，工程化活菌治疗必须在人体中证明强大而可靠的治疗效益。
公众接受代表另一重要挑战。尽管工程化微生物可能比传统益生菌提供更高的特异性和可控性，公众对基因修饰细菌的感知仍保持谨慎，这可能对与熟悉病原近亲相关的底盘生物（如大肠杆菌）尤为相关。因此，初始转化在具有明确未满足医疗需求的疾病聚焦应用中可能更可行，此时收益-风险平衡更易论证。相比之下，将工程化细菌立即定位为健康人群的日常健康产品可能面临更强阻力。阶梯式转化路径可能更为适宜：工程化活菌治疗应首先针对具有可测量临床终点的明确疾病进行验证，待安全性、疗效、制造质量和公众信心确立后再扩展至更广泛的预防健康或健康应用。
展望未来，成功转化将取决于市场机遇、技术成熟度、监管策略和社会接受度的协调。未来工作应聚焦选择适当疾病适应症、改进底盘安全性和稳定性、开发可靠遗传控制系统、标准化制造和质量控制，以及清晰沟通工程化菌株与病原微生物的区别。EcN作为讨论的有用模式底盘，结合了益生菌历史、工程可及性、瞬时肠道定植和OMV产生等独特革兰氏阴性特征。更广泛而言，工程化活菌治疗的未来可能涉及根据疾病背景、递送途径、安全要求和治疗功能选择的多种微生物底盘。若这些挑战得以解决，工程化益生菌和活菌治疗有望帮助弥合庞大商业益生菌市场与数量有限、机制驱动的临床验证微生物治疗之间的差距。
