不同细菌特性影响其沿真菌网络(菌索/菌丝网)的扩散(Diverse Bacterial Properties Influence Dispersal Along Fungal Networks)

《Journal of Fungi》：Diverse Bacterial Properties Influence Dispersal Along Fungal Networks

　　

摘要：细菌-真菌互作(Bacterial–fungal interactions)在微生物群落中普遍存在，真菌常通过菌丝(hyphae)构建的网络促进细菌扩散。研究人员利用微流控装置(microfluidic device)检测了多种细菌在单独培养(monoculture)与黄曲霉(Aspergillus flavus)共培养(coculture)条件下的扩散差异。多数细菌在共培养时迁移距离更远，但并非绝对——仅于共培养中表现出显著扩散能力的两种细菌为重要人类病原菌单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。机制上，L. monocytogenes的扩散依赖鞭毛(flagella)，鞭毛缺失突变体(ΔflaA)扩散受损，而上调鞭毛表达的ΔmogR菌株扩散增强。与之相反，无鞭毛的S. aureus沿菌丝呈独特的波状(wave-like)扩散模式，该现象在缺陷型agr群体感应(Quorum-Sensing, QS)突变体——即无法合成酚溶性类模素(Phenol-Soluble Modulins, PSMs)的菌株——中被消除。在三物种共培养(L. monocytogenes + S. aureus + A. flavus)中，L. monocytogenes抑制S. aureus沿菌丝扩散，且该抑制依赖于L. monocytogenes完整的QS系统。本研究揭示细菌沿真菌网络的运移源于物种特异性的多样机制，包括鞭毛、转录调控、潜在的QS介导的种间互作，以及其他值得深入探究的扩散现象。

研究背景与立题依据

细菌与真菌在土壤、食品及临床等各类生境中广泛共存并发生多样的共生互作(symbiosis)，真菌菌丝(mycelium/hyphae)可作为结构性支架，其表面水膜(water film/water layer)能协助具运动性的细菌借助鞭毛游动(flagellar swimming)或滑移(gliding)实现跨基质迁移，即"菌丝辅助扩散(fungal-assisted bacterial dispersal)"。然而，目前对鞭毛缺失的非运动(non-motile)细菌如何借助真菌网络扩散、不同菌种扩散机制是否存在物种特异性(species-specific mechanism)、以及多菌种共存时的竞争互作是否影响扩散均缺乏系统认识。为明确不同细菌利用真菌菌丝网络扩散的策略及分子机制，并验证扩散效率与菌种特性（如鞭毛、革兰氏染色、群体感应）的关系及种间互作的影响，研究人员以常见土壤腐生菌兼种子病原菌黄曲霉(Aspergillus flavus)为真菌模型，选取环境及实验室来源的8种革兰氏阳性和阴性细菌，利用微流控芯片结合基因敲除突变体、荧光显微成像及选择性平板计数，探究各菌种的扩散模式及涉及的分子机制。

本文发表于《Journal of Fungi》。

主要关键技术方法

研究人员构建填充1.6%水琼脂(water agar)的微流控芯片(microfluidic device)，以黄曲霉(Aspergillus flavus)为真菌共培养对象，选取单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，含野生型WT、鞭毛突变体ΔflaA、转录抑制因子缺失突变体ΔmogR及ΔmogRΔflaA双突变体、群体感应突变体ΔagrD)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，含野生型及agr操纵子各组分缺失突变体ΔagrA/ΔagrB/ΔagrC、PSM缺失突变体Δα/β HLD)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，野生型PAO1及QS突变体PAO-JP2、鞭毛突变体ΔfliC)、青枯菌(Ralstonia solanacearum，野生型及鞭毛突变体ΔfliC)及其他数种革兰氏阳性/阴性细菌共8株为研究对象。分别进行细菌单独培养和真菌-细菌共培养接种，30℃孵育48 h后收集出口端(Output port)液体进行系列稀释涂布，真菌-细菌混合样品采用添加放线菌酮(cycloheximide, 100 μg/mL)的CPGY平板抑制真菌生长，三菌种共培养采用链霉素(streptomycin, 100 μg/mL) CPGY平板选择性分离L. monocytogenes及甘露醇盐琼脂(Mannitol Salt Agar, MSA)选择性分离S. aureus；S. aureus agr突变体经血琼脂溶血活性验证表型。活细胞采用RFP/GFP荧光标记，通过倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse TI)配合NIS Elements AR及Fiji软件进行成像与分析，数据统计采用Mann–Whitney U检验、t检验及双因素ANOVA(Tukey's HSD)等。

研究结果

3.1. Aspergillus flavus Enhances Dispersal of Multiple Bacterial Species Through Microfluidic Channels

研究人员将8种细菌分别与A. flavus共培养，以单独培养为对照，通过微流控通道出口CFU计数评估扩散能力。结果显示R. solanacearum和P. aeruginosa在单独及共培养中均可到达出口；L. monocytogenes、B. velezensis、S. aureus、M. luteus和B. unamae仅在共培养中成功扩散至出口；Gluconobacter sp.在两种条件下均未扩散。表明A. flavus菌丝网络可促进多种细菌扩散，且扩散能力具菌种特异性，所测4种革兰氏阳性菌均严格依赖真菌共培养方可扩散。

3.2. Flagella Are Critical for Listeria monocytogenes but Not Pseudomonas aeruginosa or Ralstonia solanacearum Dispersal

研究人员比较L. monocytogenes(ΔflaA)、P. aeruginosa(ΔfliC)和R. solanacearum(ΔfliC)野生型与鞭毛突变体在单独及共培养中的扩散。P. aeruginosa和R. solanacearum鞭毛突变体与野生型无显著差异；L. monocytogenes共培养中共ΔflaA突变体无法到达出口，野生型可到达，单独培养两者均不能到达出口，显微观察显示野生型可部分进入通道并形成生物膜屏障(biofilm rim)后停滞，ΔflaA则无此前期分散。结论：L. monocytogenes沿真菌网络的扩散严格依赖鞭毛，而P. aeruginosa和R. solanacearum在此体系中不依赖鞭毛（可能借助IV型菌毛Type IV pili, T4P等其它机制）。

3.3. Motility Barriers and Flagellar Function Define Temperature-Dependent Dispersal of Listeria monocytogenes

研究人员在25℃、30℃、35℃下检测L. monocytogenes野生型及ΔflaA与A. flavus共培养和单独培养的扩散。发现温度越低，野生型在通道内迁移越远，单独培养时低温下可更深入通道形成生物膜屏障，共培养时可更高效率抵达出口；ΔflaA在任何温度下均无扩散。显微观察显示A. flavus菌丝穿透L. monocytogenes形成的生物膜屏障时被细菌包裹，并随菌丝生长携带细菌越过屏障继续延伸。结论：L. monocytogenes扩散受温度依赖的鞭毛运动调控，低温促进鞭毛表达从而增强扩散。

3.4. Deletion of mogR Enables Independent Channel Traversal by Listeria monocytogenes

研究人员在35℃（此温度通常抑制L. monocytogenes鞭毛表达）检测ΔmogR（解除鞭毛基因转录抑制）、ΔmogRΔflaA双突变体与野生型的扩散。结果35℃时野生型需共培养才能抵达出口，ΔmogR可在单独及共培养中低水平穿越通道抵达出口且共培养CFU高于野生型，ΔmogRΔflaA双突变体无扩散。结论：MogR对鞭毛基因的表达抑制是温度依赖扩散限制的因素，去除MogR可使L. monocytogenes在高温下去除对真菌共培养的严格依赖，进一步证实鞭毛的核心作用。

3.5. Quorum-Sensing-Regulated Surfactant Activity May Mediate Staphylococcus aureus Dispersal

研究人员以RFP标记S. aureus进行延时显微观察，发现无鞭毛的S. aureus在菌丝分叉/交汇处聚集形成团块(clump)，达阈值浓度后出现快速波状(wave-like)扩散。采用agr QS缺失突变体(ΔagrABC、ΔagrA/B/C)及PSM合成缺失突变体(Δα/β HLD)检测，所有QS及PSM缺失突变体均无法扩散出接种孔；P. aeruginosa QS突变体(PAO-JP2)扩散无影响。结论：无鞭毛S. aureus沿真菌网络的扩散依赖功能性agr群体感应系统及下游酚溶性类模素(Phenol-Soluble Modulins, PSMs)的合成，为非运动菌借助真菌支架扩散的新机制。

3.6. Interbacterial Competition Along the Fungal Networks

研究人员进行L. monocytogenes + S. aureus + A. flavus三菌种共培养，发现仅有L. monocytogenes被回收到出口，S. aureus滞留于进样口；当使用L. monocytogenes ΔagrD(QS缺陷)替代野生型时，S. aureus恢复扩散能力。结论：L. monocytogenes完整QS系统可抑制S. aureus依赖agr/PSM的扩散，暗示L. monocytogenes可通过QS拮抗干扰S. aureus的agr系统，体现真菌网络上种间竞争对扩散的调控。

讨论与结论总结

本研究揭示不同细菌沿A. flavus菌丝网络的扩散模式具显著菌种特异性，不单纯由革兰氏染色、鞭毛有无或形态决定。L. monocytogenes依赖鞭毛运动沿菌丝滑移，该过程受温度及MogR转录抑制调控；S. aureus作为非运动菌，其扩散依赖agr QS调控的PSM产生及菌丝分支处聚集触发的波状脱离/扩散，属此前未被阐明的真菌网络非运动扩散机制；P. aeruginosa与R. solanacearum鞭毛缺失不影响扩散，提示存在鞭毛以外的迁移策略（如T4P介导的抽搐运动twitching motility）。三菌种互作实验表明L. monocytogenes功能性QS系统可竞争抑制S. aureus的扩散，提示环境中QS交叉拮抗可塑造微生物空间分布。微流控体系虽无法完全模拟自然环境复杂度，但排除被动液流为主因（突变体无扩散），支持主动生物机制。未来需结合高分辨成像与转录组学解析菌-菌及菌-真菌分子对话。

研究结论翻译：黄曲霉(Aspergillus flavus)可促进多物种细菌通过琼脂基质的扩散，该促进效果具菌种特异性；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)沿真菌网络的扩散严格依赖鞭毛(flagella)及鞭毛基因转录抑制因子MogR的调控，低温增强其扩散；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为无鞭毛菌种，其沿菌丝扩散依赖功能性agr群体感应(Quorum-Sensing, QS)系统及下游酚溶性类模素(Phenol-Soluble Modulins, PSMs)的合成，表现为菌丝分支处聚集后的波状扩散；L. monocytogenes完整QS系统可抑制S. aureus上述扩散，QS缺陷则解除抑制；细菌借助真菌菌丝网络的运移源于多样且物种特异的机制，包括鞭毛、转录调控及种间QS互作等。