PA5201通过结合铜绿假单胞菌PexsC启动子抑制III型分泌系统

《Microbiology Spectrum》：PA5201 represses type III secretion system by binding to the PexsC promoter in Pseudomonas aeruginosa

　　

摘要：III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）重要的毒力决定因子，受主调控因子ExsA激活。exsA由两个不同的启动子转录：其操纵子启动子PexsC及自身启动子PexsA。本研究鉴定出Tex家族蛋白PA5201是铜绿假单胞菌中T3SS的新型抑制因子。PA5201直接结合PexsC启动子并抑制其活性。敲除PA5201可提高T3SS表达、细菌细胞毒性和小鼠急性肺炎模型中的菌载量，而过表达PA5201则降低T3SS表达。报告基因实验和蛋白质免疫印迹分析进一步表明，PA5201介导的PexsC抑制不依赖于ExsA且不发生转录后水平调控。电泳迁移率变动实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）显示PA5201结合至exsC起始密码子上游?72至?45 bp区域。综上，本研究确定PA5201为铜绿假单胞菌中新型T3SS抑制因子，并阐明其分子作用机制。

论文解读：PA5201通过结合P_exsC启动子抑制铜绿假单胞菌III型分泌系统

一、研究背景与立项依据

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的人类机会性致病菌，可引起呼吸机相关性肺炎、血流感染及囊性纤维化患者慢性肺部感染。其致病力依赖于多种毒力因子，其中III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）作为"分子注射器"将效应蛋白注入宿主细胞，在急性感染定植与致病中发挥关键作用。T3SS受主转录激活因子ExsA调控，ExsA通过伙伴切换机制（ExsC/ExsD/ExsE）受环境信号调节，且exsA本身受P_exsC（操纵子启动子）和P_exsA（自身启动子）双重驱动。已知Vfr、MvaT、MvaU、VqsM、Fis等调控P_exsA，MvaT、AmrZ和PsrA调控P_exsC，但T3SS调控网络尚不完全清楚。PA5201是Tex家族转录辅助蛋白，虽在铜绿假单胞菌中已有晶体结构报道，但其生物学功能未知。研究人员前期通过DNA pull-down联合质谱筛选P_exsC启动子结合蛋白时发现PA5201，因此开展本研究探究PA5201在T3SS调控中的功能与分子机制。本文发表于《Microbiology Spectrum》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用的主要方法包括：（1）构建铜绿假单胞菌PAK野生型、ΔPA5201敲除株及互补株，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化His标签PA5201蛋白；（2）电泳迁移率变动实验（EMSA）及竞争EMSA检测PA5201与P_exsC启动子DNA片段的直接结合及特异性；（3）β-半乳糖苷酶报告实验（Miller Units）检测P_exsC-lacZ和P_exoT-lacZ转录活性；（4）蛋白质免疫印迹（Western blot）检测T3SS效应蛋白ExoS表达与分泌及RpoA内参；（5）实时荧光定量PCR（real-time qPCR）检测exsC、exsA、exoS mRNA水平；（6）A549细胞感染细胞毒性实验（结晶紫染色法）评估细菌细胞毒力；（7）BALB/c小鼠急性肺炎模型评估肺部菌载量（CFU）。

三、研究结果

PA5201 binds to P_exsC, the operon promoter of T3SS master activator ExsA

研究人员通过EMSA发现纯化的PA5201-His可使P_exsC启动子DNA探针发生迁移且呈剂量依赖性，而对PA5201基因片段无结合；竞争EMSA显示FAM标记的P_exsC探针与PA5201结合可被过量未标记P_exsC竞争掉，但不能被无关P_exsD片段竞争，证实PA5201直接、特异地结合P_exsC启动子。

PA5201 controls ExoS expression and pathogenicity of P. aeruginosa

Western blot显示ΔPA5201突变体中ExoS的表达和分泌均较野生型PAK显著升高，互补株恢复至野生型水平；过表达PA5201则降低ExoS表达与分泌。A549细胞感染实验中ΔPA5201细胞毒性显著增强，互补后恢复。小鼠急性肺炎模型中ΔPA5201感染肺组织菌载量显著高于PAK和互补株，而两菌株体外LB培养基生长曲线无差异，表明PA5201缺失增强T3SS依赖的毒力而非生长优势，确认PA5201是T3SS负调控因子。

PA5201 represses P_exsCpromoter activity independently of ExsA protein

qPCR显示ΔPA5201中exsC、exsA、exoS的mRNA水平上调，过表达PA5201下调其转录。P_exsC-lacZ报告基因在ΔPA5201中β-半乳糖苷酶活性升高，过表达PA5201降低活性，P_exoT-lacZ呈相同趋势。在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达PA5201也使P_exsC-lacZ活性下降，证明直接抑制。在PAKΔexsA背景下过表达PA5201仍显著降低P_exsC-lacZ活性，证实PA5201直接抑制P_exsC启动子且不依赖于ExsA蛋白。

Repression of exsC does not occur at the post-transcriptional level

为检验PA5201是否通过C端S1 RNA结合域抑制exsC翻译，研究人员构建了由P_tac驱动、携带不同长度5′非翻译区（5′ UTR，?86 bp或?45 bp）或仅含核糖体结合位点（RBS）的C端Flag标签exsC表达载体。qPCR显示ΔPA5201与野生型中exsC-Flag mRNA水平无差异，Western blot显示ExsC-Flag蛋白水平也无差异，表明PA5201不以转录后（翻译抑制）方式调控exsC。

PA5201 binds to the ?72 to ?45 bp region relative to the exsC translational start codon and inhibits transcription

系列截短P_exsC启动子片段EMSAs显示含?72至?45 bp的片段（P_exsC-7、P_exsC-8、P_exsC-9）可被PA5201迁移，而缺失该区域的P_exsC-10及P_exsCmut-6（?72~?45缺失）不能被结合，定位结合位点为exsC起始密码子上游?72至?45 bp。构建P_exsC-6-lacZ与P_exsCmut-6-lacZ报告质粒，野生型与ΔPA5201间P_exsC-6-lacZ活性有显著差异，而P_exsCmut-6-lacZ在两者间无差异，证实该?72~?45 bp区域是PA5201介导P_exsC转录抑制所必需的DNA结合位点。

四、讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，PA5201为Tex家族蛋白，含N端螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HtH）域、YqgF同源域、螺旋-发夹-螺旋（helix-hairpin-helix，HhH）域及C端S1域。本研究证明PA5201直接结合DNA（而非RNA）发挥转录抑制功能，不通过转录后机制抑制exsC。已报道MvaT和AmrZ也结合并抑制P_exsC，PsrA则激活之；PA5201结合位点（?72~?45 bp）与ExsA结合区（?91~?49 bp）重叠，提示PA5201可能通过阻碍ExsA或RNA聚合酶（RNAP）结合/启动子清除来抑制转录，且PA5201曾被发现与RNA聚合酶共纯化，但具体互作模式待进一步研究。值得注意的是PA5201与psrA均在小鼠急性肺炎感染条件下被诱导表达，提示铜绿假单胞菌可通过上调T3SS抑制因子进行自身反馈调节，避免过度耗能的T3SS活化。

研究结论翻译：

PA5201是铜绿假单胞菌中Tex家族蛋白，此前功能未明。本研究发现PA5201是T3SS的新型抑制因子。PA5201直接结合P_exsC启动子抑制exsA转录进而抑制T3SS表达。PA5201含C端S1基序，但本研究显示其直接结合DNA进行转录抑制而不调控exsC的转录后表达。PA5201结合于exsC起始密码子上游?72至?45 bp区域并抑制P_exsC活性。此研究揭示了铜绿假单胞菌T3SS的新调控因子，并阐明了PA5201介导T3SS抑制的分子机制，深入研究PA5201的全局作用有望为控制铜绿假单胞菌感染提供新思路。