拮抗酵母Meyerozyma guilliermondii SR1对沙糖桔采后蓝霉病的生物防治

《Horticulturae》：Postharvest Biocontrol of Blue Mold in Shatangju Mandarins by the Antagonistic Yeast Meyerozyma guilliermondii SR1

　　

由Penicillium italicum引起的蓝霉病会导致严重的组织腐烂并限制采后货架期，是沙糖桔（Citrus reticulata cv. Shatangju）商业供应链的主要制约因素。在本研究中，研究人员评估了拮抗酵母Meyerozyma guilliermondii SR1对沙糖桔采后蓝霉病的生物防治效果。结果表明，SR1显著抑制了P. italicum的体外生长，延缓了病害进程，并限制了接种果实中病原菌的产孢。此外，SR1迅速定殖于果实伤口以建立种群优势，并增强了宿主果实的抗氧化防御能力。同时，SR1处理显著减少了采后失重率，与对照组相比，总可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）无显著差异。总之，M. guilliermondii SR1对沙糖桔采后蓝霉病表现出显著的生物防治效果，这为绿色柑橘采后保鲜剂的研发提供了实验依据。

**论文解读：拮抗酵母Meyerozyma guilliermondii SR1对沙糖桔采后蓝霉病的生物防治机制与应用潜力**

**研究背景与问题**
沙糖桔（*Citrus reticulata* cv. Shatangju）具有重要商业价值，但其薄皮且富含易损油腺，采后供应链中易受机械损伤。这些伤口容易被病原真菌*Penicillium italicum*侵染，引发蓝霉病，导致严重组织腐烂和真菌毒素污染，成为限制沙糖桔货架期的主要因素。随着病原菌抗药性的进化和全球对化学农药残留的严格限制，传统化学杀菌剂已无法满足当前绿色鲜果市场的需求。因此，开发安全、环保的果实伤口生物防治策略成为柑橘采后保鲜领域的关键研究方向。基于拮抗酵母的生物防治技术因其天然定殖于果实表面微生态系统、多数菌株被普遍认为是安全的（GRAS）且不产生有毒次级代谢产物，被广泛研究作为采后病害控制的绿色替代方案。已有研究证实多种拮抗酵母（如*Metschnikowia* spp.、*Wickerhamomyces anomalus*、*Cryptococcus laurentii*、*Rhodotorula mucilaginosa*）能有效控制柑橘采后蓝霉病，其机制包括伤口定殖与空间竞争、接触依赖性抑制病原菌发育，以及增强宿主抗氧化酶（过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT）活性以提高果实抗氧化能力。*Meyerozyma guilliermondii*已被报道具有广谱拮抗活性，并在草莓、芒果、梨等果蔬采后保鲜中展现出生防效果，同时也可作为种子包衣剂促进植株生长并诱导系统性抗性。然而，拮抗酵母的生防效果高度依赖宿主品种、病原菌种类和环境条件。尽管已有研究证实*M. guilliermondii*对沃柑、柠檬等柑橘品种有效，但其对沙糖桔*P. italicum*的特异性抑制作用仍不清楚。此外，伤口定殖和宿主抗氧化防御激活作为一般生防机制已被广泛认可，但*M. guilliermondii*在高度感病的沙糖桔组织中的具体定殖动态和防御激发过程尚未被系统阐明。

**研究内容与结论**
本研究从健康草莓（*Fragaria ananassa* Duch.）表面分离出一株拮抗酵母SR1，通过形态观察、26S rDNA D1/D2区测序及系统发育分析鉴定为*M. guilliermondii*，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC，编号CGMCC NO.34445）。研究人员在室温贮藏（25°C）条件下，通过体外拮抗试验和果实接种试验评估了SR1对沙糖桔采后蓝霉病的生防效果，并探究了其伤口定殖动态和对宿主抗氧化防御酶活性的影响，同时监测了SR1处理后沙糖桔基本品质指标（总可溶性固形物TSS、可滴定酸TA、失重率）的变化。结果表明，SR1能显著抑制*P. italicum*的体外菌丝生长，延缓果实病害进程并限制病原菌产孢；SR1能快速定殖于果实伤口并建立种群优势，同时显著增强果实组织中的过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性；SR1处理显著降低了采后失重率，且对TSS和TA无显著影响。该研究为开发基于酵母的柑橘采后生物保鲜剂提供了实验基础，论文发表在《Horticulturae》。

**关键技术与方法**
研究人员从健康草莓果实表面分离拮抗酵母SR1，经26S rDNA D1/D2区扩增测序及系统发育分析进行分子鉴定，并测定其在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基中的生长动力学曲线。体外拮抗试验采用琼脂扩散法（双培养和平板对峙）评估SR1对*P. italicum*的直接拮抗活性及扩散性物质的分泌。果实体内试验通过伤口接种和全果浸泡两种预处理方式，在25°C、85%相对湿度（RH）条件下评估对蓝霉病的防治效果。伤口定殖动态采用稀释涂布平板法在YPD培养基上监测；防御酶（POD、CAT）活性通过分光光度法测定；品质指标中TSS用便携式数字折光仪测定，TA用酸碱滴定法（以柠檬酸计）测定，失重率通过连续称重计算。所有数据经SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验（p < 0.05）。

**研究结果**
**3.1 菌株SR1的分离、鉴定与生长特性**
通过形态观察和26S rDNA D1/D2区扩增（获得628 bp目标条带），BLAST同源性比对及最大似然法系统发育分析确认SR1与*Meyerozyma guilliermondii*模式菌株相似性达99.8%，紧密聚类于同一分支。生长动力学曲线显示SR1在接种后10 h即进入指数生长期，38 h达到稳定期，表明其具有快速增殖能力。

**3.2 体外拮抗试验**
双培养试验中，5天后对照组平板被*P. italicum*菌丝完全覆盖，而SR1处理组显著抑制了病原菌菌丝生长。平板对峙试验中，7天后SR1与*P. italicum*菌落交界处出现轻微抑菌圈，提示可能存在部分扩散性抗真菌物质的参与。

**3.3 果实体内生防效果评价**
伤口接种预处理和全果浸泡预处理两种方式均表明，在25°C贮藏条件下，SR1处理在接种后3、5、7天显著抑制了果实病斑扩展（p < 0.05）。伤口接种预处理更显著地控制了病斑发展，全果浸泡预处理也有效降低了病斑直径。

**3.4 伤口定殖动态与防御酶活性**
SR1接种至果实伤口后，种群数量先略有下降（第1天），第2天恢复至初始水平（约10⁵ CFU/伤口），随后经历小幅度波动，但在整个贮藏期内成功维持稳定定殖水平。生化测定显示，完全健康未接种果实（Sound）的POD和CAT活性维持较低基础水平（约38.9 U/g和8.2 U/g）；单独感染*P. italicum*的对照（Control）果实中活性显著升高至131.1 U/g和61.6 U/g，反映宿主天然基础防御反应；而SR1处理进一步显著增强两种酶活性至222.2 U/g和160.8 U/g，显著高于病原单独对照组（p < 0.05）。

**3.5 基本品质属性**
在9天贮藏期内，SR1处理组和对照组的果实失重率均呈持续上升趋势，但SR1处理组的失重率始终低于对照组，在第7天出现显著差异，第9天差异极显著——SR1处理组失重率仅为0.75%，而对照组为1.53%。内在品质监测显示，在7天贮藏过程中，对照组和SR1处理组的TSS含量维持在15.9%~18.7%之间，TA含量在0.36%~0.57%之间波动，各时间点两组间TSS和TA均无显著差异。

**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管SR1不能完全阻止感染后的组织软化，但其在延缓病害进程和显著限制病原菌产孢方面的强大效果表明，SR1能有效干扰*P. italicum*在感病组织中的初始侵染和后续定殖阶段。体外试验提示扩散性抗真菌物质的分泌可能部分贡献抑制作用，但主要拮抗作用可能依赖于其他机制，这与某些采后拮抗酵母的特征一致。SR1通过短停滞期和强增殖能力快速适应伤口微环境并建立高种群密度，通过物理性微生态屏障占据伤口处的空间和营养资源，从而阻碍病原菌的初始建立和菌丝发育。除空间竞争外，SR1的定殖还显著改变了宿主果实的抗病生化指标——病原菌感染通常触发强烈氧化应激导致活性氧（ROS）积累和细胞膜破坏，而SR1处理显著增强了沙糖桔果实中POD和CAT的活性，强化了抗氧化防御系统，有助于减轻*P. italicum*引起的氧化损伤，维持细胞稳态，提高整体抗病性。在保鲜品质方面，SR1处理有效减缓了失重（9天时失重率仅0.75% vs 对照1.53%），这主要归因于快速伤口定殖形成物理屏障限制了过量水汽蒸腾，且该保护作用未对核心糖酸代谢（TSS和TA）产生负面影响。结论部分翻译：总之，*M. guilliermondii* SR1对沙糖桔采后蓝霉病表现出强大的生物防治效果。要将这一绿色保鲜技术转化为工业应用，SR1可被开发为稳定的生物杀菌剂配方（如液体悬浮剂、可湿性粉剂或可食用涂层添加剂）。在现代商业包装厂中，这些生物制剂可无缝集成到现有的采后加工线上，在冷链分配前通过标准的浸渍或在线喷雾系统施用。需要指出的是，本研究中实验概念验证所用的12 h浸泡时间必须进一步优化为快速浸渍或喷雾方案（如1~2 min），以满足商业柑橘加工的实际产能需求。本研究为开发此类基于酵母的生物防治策略提供了坚实的理论和实践基础。