利用多视角形态、色彩纹理和多光谱特征进行可解释的生菜鲜重估计基于机器学习

《Horticulturae》：Utilizing Multi-View Morphological, Color–Textural and Multispectral Features for Interpretable Estimation of Lettuce Fresh Weight Using Machine Learning

　　

MYB转录因子（TFs）在植物色素沉着中发挥关键的调控功能；然而，三角梅属（Bougainvillea spp.）中MYB家族的组成以及苞片着色的调控机制尚未被系统研究。本研究通过生物信息学方法，从三角梅基因组中检测到163个BbMYB TFs，并将其分为三个亚家族：1R-MYB（13个成员）、R2R3-MYB（144个成员）和3R-MYB（6个成员）。系统发育分析进一步将BbMYB蛋白分配到15个亚组。保守基序分析显示，大多数BbMYB蛋白在N端含有保守基序，且R2R3-MYB蛋白的R2和R3重复区共同拥有五个高度保守的色氨酸残基。基因结构分析表明，BbMYB基因含有0到12个内含子，并在同一亚组内呈现保守的内含子分布模式。启动子顺式作用元件分析共检测到54个元件，分为四类：激素响应、胁迫响应、发育相关和光响应元件。根据转录组数据和逆转录定量聚合酶链式反应验证，BbMYB6、BbMYB8和BbMYB10在黄色苞片中显著上调，而BbMYB69、BbMYB89和BbMYB148在红色苞片中显著上调。病毒诱导基因沉默实验进一步表明，沉默BbMYB6导致黄色苞片褪色且类黄酮含量显著降低，而沉默BbMYB69导致红色苞片褪色且甜菜色素（betacyanin）含量显著下降，提示这两个基因分别参与正向调控黄色和红色苞片的着色。本研究全面分析了三角梅的MYB基因家族，确定了与苞片着色相关的关键候选基因，为三角梅苞片颜色的分子育种奠定了理论基础和遗传资源。

**研究背景与目的**
植物花色和叶色由类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素（betalain）等色素决定，其中MYB转录因子（TFs）是调控植物色素生物合成的主要转录调控因子。三角梅（Bougainvillea spp.）属于石竹目（Caryophyllales）紫茉莉科，其苞片颜色变异丰富，是主要的观赏性状。已有研究表明，类黄酮主要调控黄色苞片着色，而甜菜色素（betacyanin）负责红色苞片着色。然而，三角梅中MYB转录因子家族的系统鉴定及其在苞片颜色调控中的作用尚不清楚。为此，研究人员开展了全基因组水平的BbMYB基因家族鉴定，并分析不同颜色苞片中MYB基因的表达模式，旨在阐明MYB TFs在苞片着色中的功能，为三角梅苞片颜色的分子育种提供理论基础和遗传资源。该论文发表在《Horticulturae》。

**主要关键技术方法**
研究人员从三角梅基因组中鉴定MYB基因家族，采用Hidden Markov Model（HMM）和BLASTP双重搜索，经NCBI-CDD和Pfam域验证，最终获得163个BbMYB基因，并根据MYB重复数分为三个亚家族。系统发育分析运用最大似然法（ML）构建了三角梅、拟南芥和水稻MYB蛋白的系统树。利用TBtools进行保守基序、基因结构和启动子顺式作用元件分析。表达分析基于已发表的转录组数据，样本包括三个三角梅品种：白色苞片（Bougainvillea spectabilis ‘White Stripe’）、黄色苞片（Bougainvillea × buttiana ‘Golden Glow’）和红色苞片（Bougainvillea × buttiana ‘Chitra’），每个颜色组三个生物学重复。通过RT-qPCR验证候选基因表达，并采用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术对BbMYB6和BbMYB69进行功能验证，分别检测沉默后类黄酮和甜菜色素含量变化。

**研究结果**
**3.1 三角梅MYB基因的鉴定与理化性质分析**
通过NCBI-CDD域筛选，在三角梅基因组中检测到163个MYB基因（BbMYB1至BbMYB163），分为1R-MYB（13个）、R2R3-MYB（144个）和3R-MYB（6个）三个亚家族，其中R2R3-MYB占比最高（88.34%）。编码蛋白长度157–1310氨基酸，分子量17.33–144.28 kDa，等电点4.86–10.61，不稳定系数30.46–70.42，所有蛋白均为亲水性。

**3.2 MYB蛋白的系统发育分析**
将三角梅、拟南芥和水稻的MYB蛋白进行序列比对并构建ML系统树，共分为19个亚组（A–S），其中BbMYB成员分布于15个亚组，未在C、H、R、S亚组中检测到。M亚组含最多BbMYB成员（23个，占14.11%），E亚组最少（1个，0.61%），暗示进化过程中MYB基因谱系发生了差异扩增与收缩。

**3.3 BbMYB的保守基序、基因结构与序列比对分析**
保守基序分析显示，同一亚组内成员基序组成高度相似，如P亚组6个成员均含Motifs 5、3、2、1、4、6；大多数BbMYB蛋白含Motifs 3、2、1、4。R2R3重复区的多重序列比对表明，R2重复含三个高度保守的色氨酸（W）残基，R3重复含两个保守色氨酸残基，共同形成疏水核心并采取螺旋-转角-螺旋（HTH）结构。基因结构分析显示，BbMYB基因内含子数0–12个，主要分布在2–4个内含子（72.4%），其中2个内含子的基因最多（98个，60.1%）。A、D、E亚组所有成员均含4个以上内含子；M亚组4个基因和F亚组12个基因无内含子，表明发生了内含子丢失事件。

**3.4 BbMYB基因启动子顺式作用元件分析**
利用PlantCARE数据库检测到54个假定的功能顺式作用元件，分为激素响应（水杨酸、赤霉素、生长素、脱落酸、茉莉酸）、胁迫响应（厌氧诱导、脱水、低温、免疫、伤口）、发育相关（种子贮藏蛋白、茎尖分生组织、昼夜节律、胚乳特异性、叶肉细胞形态、细胞分裂周期、胚发育、胚乳发育抑制）和光响应（28种，包括G-box、GT1-motif等）四类。

**3.5 黄色苞片中BbMYB基因的表达分析**
通过白色苞片（Bou_W）与黄色苞片（Bou_Y）的RNA-seq比较，鉴定出157个差异表达BbMYB基因；K-means聚类分析在亚类4中识别出56个持续上调基因。RT-qPCR验证了表达上调最显著的BbMYB6、BbMYB8和BbMYB10，结果与RNA-seq一致，提示这些基因可能参与黄色苞片着色。

**3.6 红色苞片中BbMYB基因的表达分析**
比较白色苞片（Bou_W）与红色苞片（Bou_R）的RNA-seq数据，发现120个BbMYB基因在从白色到红色转变中上调；K-means聚类显示亚类3中有72个基因持续上调。RT-qPCR验证了BbMYB69、BbMYB89和BbMYB148的高表达模式，与RNA-seq吻合，表明它们可能参与红色苞片着色调控。

**3.7 BbMYB6和BbMYB69在苞片着色中的功能鉴定**
基于表达水平优先策略，选择黄色苞片中表达最高的BbMYB6和红色苞片中表达最高的BbMYB69进行VIGS实验。沉默BbMYB6后，黄色苞片可见褪色，且类黄酮含量显著降低（图7A–C）；沉默BbMYB69后，红色苞片明显褪色，甜菜色素含量显著降低（图7D–F）。这表明BbMYB6通过调控类黄酮积累参与黄色苞片着色，BbMYB69通过影响甜菜色素含量参与红色苞片着色，两者均为正向调控因子。

**总结与讨论**
讨论部分指出，本研究首次系统鉴定了三角梅163个MYB转录因子，R2R3-MYB亚家族占比最高（88.34%），符合双子叶植物分布规律。R2和R3重复区中高度保守的色氨酸残基与矮牵牛、鼠尾草等一致，说明MYB蛋白的结构保守性对其功能执行至关重要。系统发育分析将BbMYB归入15个亚组，缺失C、H、R、S亚组可能由于谱系特异基因丢失或序列分歧。同一亚组内保守基序和基因结构的高相似性提示功能保守，而亚组A内基序差异可能与功能分化有关。启动子元件分析发现大量光响应和激素响应元件，与MYB整合环境及内源信号调控次级代谢的已知功能一致。表达谱和VIGS结果证实BbMYB6和BbMYB69分别正向调控类黄酮和甜菜色素积累，这与火龙果中HuMYB1的抑制机制不同，表明MYB在不同物种和色素代谢通路中可发挥正/负双重调控作用。与石竹目中已鉴定的甜菜色素相关MYB比较，BbMYB69属于不同进化支，提示甜菜色素调控可能在石竹目中多次独立进化。研究局限性包括仅验证了6个候选基因中的2个，未提供转录因子与靶基因启动子直接结合的分子证据，VIGS系统为瞬时作用，且不同颜色苞片来自不同品种可能引入基因型差异。未来需通过多基因沉默、酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）及CRISPR/Cas9稳定转化等方法进一步验证。

**结论**
从三角梅基因组中共鉴定出163个BbMYB基因，分为三个亚家族（1R-、R2R3-和3R-MYB）；其保守结构和启动子顺式元件提示在色素调控中的可能作用。功能实验表明，沉默BbMYB6降低类黄酮水平并使黄色苞片褪色，沉默BbMYB69降低甜菜色素水平并使红色苞片褪色，支持它们在苞片着色中的正向作用。这些结果提供了多项实用价值：三角梅全基因组MYB资源、用于快速基因功能测试的VIGS工作系统，以及两个用于未来苞片颜色育种的靶基因（BbMYB6和BbMYB69）。总体而言，该研究既为色素沉着提供了机制性见解，也为观赏植物改良提供了有用工具。