FSIWsim：一种基于提取物混合物的LC-MS/MS数据的片段大小和强度加权MS2相似性分析方法，用于快速识别并标注大戟属植物Euphorbia helioscopia L.中的已知天然产物

《Analytica Chimica Acta》：FSIWsim: Fragment Size- and Intensity- Weighted MS2 Similarity for rapid identification and analogue annotation of known natural products in Euphorbia helioscopia L. based on LC-MS/MS data of the extract mixture

　　邓雅玲|白彩红|张博文|于晓梅|胡伟嘉|胡宇|胡凯丰中国成都611137，成都中医药大学西南中药资源国家重点实验室摘要：背景在复杂的植物提取物中识别已知的天然产物对于植物代谢组学研究、天然产物去重复以及从草药中发现生物活性成分至关重要。结果我们提出了FSIWsim，这是一种基于LC-MS/MS数据的、考虑片段大小和强度的MS2相似性算法，用于在复杂提取物中识别天然产物。FSIWsim通过计算查询谱与参考谱之间的MS2光谱余弦相似度来进行排序，这些参考谱来自包含677,356种化合物的精心整理的MS2光谱数据库。相似度评估是在一个综合特征空间中进行的，该空间涵盖了所有匹配的片段离子和中性丢失物以及未匹配的片段离子，并且根据片段大小和强度进行加权。在CASMI 2017数据集上，FSIWsim的Top-1识别准确率为45.96%。使用43种经过认证的天然产物标准对FSIWsim进行验证时，其Top-5准确率为90.70%。将FSIWsim应用于大戟属植物Euphorbia helioscopia L.的提取物后，成功识别出了101种已知天然产物，其中20种通过真实标准得到确认。对于那些未能被正确识别的化合物，可以通过子结构或结构相似性搜索，在更广泛的化学结构数据库中找到与已识别类似物结构相似的候选物，从而为查询谱提供合理的注释。意义FSIWsim提供了一种可靠的结构性相似度衡量方法，可作为在复杂植物提取物中识别已知天然产物的有效替代工具，同时还能为那些不在光谱数据库中但与已识别类似物结构相似的化合物提供注释。引言在复杂的植物提取物中识别已知的天然产物对于植物代谢组学研究、天然产物去重复以及从草药中发现活性成分具有重要意义。此前，我们开发了一种基于1H-13C异核相关性的2D NMR方法，用于快速识别 crabapple粗提取物中的已知天然产物[1]。然而，1H-13C相关性2D NMR方法的灵敏度相对较低，覆盖范围也有限，因为只有大约1.1%含有自然丰度13C同位素的分子能够产生可检测的NMR信号。无目标超高效液相色谱-高分辨率质谱技术则是一种更为灵敏的分析技术，能够快速获取复杂植物提取物中数百种天然产物的多维信息，包括保留时间、MS1和MS2[2][3]。天然产物结构识别通常依赖于库匹配，即评估查询化合物与参考化合物之间的光谱和色谱相似性。然而，实验测得的保留时间往往受到色谱条件的影响，如流动相组成、柱型以及分离温度等[4]。因此，由于不同实验平台和公共数据库之间重现性较差，保留时间在天然产物识别中的作用较为有限。虽然MS1和MS2的裂解模式能提供更多的结构信息，但仅依据MS1前体离子和MS2裂解模式来准确识别相关天然产物仍然是一个重大挑战[5]。传统的MS2光谱匹配方法主要关注片段离子的比较，而中性丢失物在相似性评分中往往被忽视[6]。例如，MS-DIAL程序在计算MS2光谱相似度时会利用点积、反点积以及与参考谱匹配的片段离子比率等综合值[7]。这种方法体现了目前对片段离子匹配的依赖，而中性丢失物通常得到的重视程度较低。通常，最初的候选结构是根据MS2光谱相似性提出的，即通过将实验测得的MS2光谱与MassBank和GNPS等数据库中已知结构的参考光谱进行比较[8][9]。这些数据库提供了关于天然产物的宝贵MS2信息，有助于识别复杂样本中的天然产物。不幸的是，尽管人们一直在努力扩充和完善这些数据库，但目前它们仍然远未能涵盖所有已知天然产物的实验数据[10]。因此，对于那些未被纳入任何光谱库的天然产物来说，简单的库匹配仍然是一项挑战。在这项工作中，我们整合了一个全面的光谱数据库，其中包含了来自多个平台和实验室的677,356种已知天然产物的MS2光谱，并提出了一种考虑片段大小和强度的MS2相似性策略（FSIWsim），用于识别复杂植物提取物中的天然产物并对其进行类似物注释。当不明确考虑电荷状态时，所有可能对应于片段离子或中性丢失物的光谱特征统称为“片段”。所谓“片段大小”，指的是片段的质量。在单电荷离子的假设下，片段离子的片段大小对应于其m/z值，而中性丢失物的片段大小则计算为前体离子与片段离子的m/z值之差，即代表中性丢失物的质量。同样，片段强度指的是特定片段的强度。FSIWsim评分策略将观察到的片段离子以及推导出的中性丢失物都纳入相似性计算中，因为这两者都能为天然产物的识别提供重要的结构信息。结构或子结构相似的天然产物往往会产生类似的中性丢失物或片段离子[11]。具有较大共同子结构的分子更有可能产生相似的MS2光谱——其特点在于后续裂解模式相似，且由共同子结构产生的产物离子或中性丢失物的标准化强度也相近[12]。FSIWsim将MS2光谱相似度计算为表示查询谱和参考谱的向量之间的余弦相似度，这些向量的特征会根据片段大小和强度在综合特征空间中进行加权，该空间涵盖了所有匹配的MS2特征以及未匹配的片段离子。需要指出的是，在光谱特征匹配时，必须考虑光谱特征物种的电荷状态，即片段离子只能与具有相同m/z值的其它片段离子进行匹配，而中性丢失物则只能与质量相同的其它中性丢失物进行匹配。除了考虑匹配的光谱特征外，FSIWsim还会对未匹配的片段离子进行惩罚，以减少误报。因此，所提出的方法能够真实反映潜在的结构相似性。通过利用光谱库中查询谱与参考谱之间的高光谱相似性，FSIWsim能够更可靠地识别天然产物，或基于相关的子结构或结构类似物对它们进行类似物注释。虽然前体m/z匹配并非FSIWsim计算的必要条件，但将准确的实验前体质量与经过注释的子结构或结构类似物相结合，可以大大有助于识别那些不在现有光谱数据库中的天然产物。我们使用CASMI 2017数据集，将FSIWsim的性能与其他化合物注释方法进行了评估。此外，我们还利用实验室之前开发的AMW-SMI算法，基于UPLC-HRMS数据检测到的色谱峰，展示了FSIWsim在识别43种经过认证的标准品以及大戟属植物Euphorbia helioscopia L.提取物中的101种天然产物方面的应用能力[13]。总体而言，FSIWsim为潜在的结构相似性提供了一种可靠的衡量方法，同时也为在复杂植物提取物中识别已知天然产物提供了一种替代工具。章节节选使用FSIWsim算法在复杂植物提取物中识别/注释天然产物的工作流程FSIWsim全面考虑了匹配的光谱特征（片段离子和中性丢失物）以及未匹配片段离子的片段大小（m/z）和强度权重。如图1所示，该工作流程包括三个主要步骤：(A)特征提取和光谱描述符计算。从查询的MS2光谱中提取特征光谱特征，包括前体m/z值、强度最高的（排名1）和第二高的（排名2）片段离子。FSIWsim直接识别已知天然产物的性能评估对于CASMI2017数据集（第4类），直接识别结果总结在表S2中。图3A展示了FSIWsim与CSI: FingerID和IOKR的性能比较。所提出的方法的Top-1准确率为45.96%，Top-3准确率为50.51%，这一数值比CSI: FingerID的Top-1准确率高出12.63%。FSIWsim的注释准确率也比IOKR高27.77%。此外，该方法还取得了F1分数。结论准确识别和注释天然产物对于从复杂植物提取物中获取具有生物学意义的见解非常重要。在本研究中，我们提出了FSIWsim作为一种替代方法，用于天然产物的识别/注释，该方法综合考虑了匹配和未匹配的片段离子及中性丢失物，并根据片段大小和标准化强度进行加权。为了提高覆盖率和适用性，我们整合了多个公共光谱数据库，并对其进行了严格的整理。CRediT作者贡献声明邓雅玲：撰写——初稿、可视化、验证、软件、方法论、研究、数据整理。胡伟嘉：数据整理。于晓梅：数据整理。张博文：数据整理。白彩红：软件。胡凯丰：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、资金获取、概念构思。胡宇：可视化数据可用性声明用于光谱相似性计算及天然产物识别/注释的R包已实现为一个开源的基于R的FSIWsim包。FSIWsim包中的所有函数都是在R（版本4.4.2，https://www.r-project.org/）中编译的。FSIWsim的源代码可在GitHub仓库https://github.com/NMRLab-Hu/FSIWsim上获取，采用MIT许可协议。安装后，可通过R命令行帮助查看一些核心功能的说明。FSIWsim支持并行处理利益冲突作者声明没有利益冲突。利益冲突声明?作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢本研究得到了中国国家自然科学基金（编号22374012）、四川省科技计划项目（编号2025ZNSFSC0591）、成都中医药大学（编号242022007）以及国家中医药管理局的创新团队和人才培养计划（编号ZYYCXTD-D-202209）的支持。