《Analytica Chimica Acta》：Spatially Confined Photocatalytic Proximity Labeling via Isothiocyanate Chemistry Enabled in Situ Surfaceome Analysis
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江倩倩|曾宇琪|陈乐|王赫|张晓哲|杨开光|张玉魁|江波|张丽华中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱研究与发展中心，医学蛋白质组学国家重点实验室，分析化学分离科学中国科学院重点实验室，中国大连116023摘要：背景作为蛋白质组中具有动态性和功能重要性的子集，表面组调控着细胞间的
江倩倩|曾宇琪|陈乐|王赫|张晓哲|杨开光|张玉魁|江波|张丽华
中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱研究与发展中心，医学蛋白质组学国家重点实验室，分析化学分离科学中国科学院重点实验室，中国大连116023
摘要：
背景
作为蛋白质组中具有动态性和功能重要性的子集，表面组调控着细胞间的通讯与信号传递，同时也是重要的治疗靶点。全面深入地绘制表面组图谱对于理解疾病的分子机制至关重要。光敏剂介导的光催化邻近标记技术作为一种强大的工具，能够在不进行基因操作的情况下，以高时空精度实现对表面组的原位标记。然而，大多数光敏剂依赖于疏水作用和静电相互作用，而这些作用很容易被膜流动性破坏，从而导致探针扩散或内吞，进而限制了标记效率。
结果
为解决这一问题，我们开发了一种空间限定的光催化邻近标记策略，该策略利用一种新型的带正电荷的异硫氰酸酯基光敏剂（SCN-Py-AcDBF）。该探针最初通过静电相互作用吸附在细胞表面，随后通过异硫氰酸酯化学作用与蛋白质形成共价键，从而限制其移动性。在光催化激活后，该探针会生成1O2，进而实现细胞表面蛋白质及附近亲核底物的共价标记。最终，我们从活的HeLa细胞中成功识别出了1124个高质量的CSPs，其中包括659种质膜蛋白，这一覆盖率远远高于没有空间限制的方法。
意义
这种基于异硫氰酸酯的空间限定策略显著减少了探针的扩散并防止了其被内吞，从而提高了标记的特异性和探针效率。该策略提升了表面组分析的准确性和覆盖范围，为全面研究表面组的动态特性和功能提供了有力的平台。
引言
细胞表面蛋白在多种细胞过程中发挥着至关重要的作用，包括细胞间通讯[1]、[2]、信号转导[3]、[4]以及与细胞外微环境的相互作用[5]。CSPs的异常表达、相互作用网络的重建或功能失调都与多种疾病的发病机制和进展直接相关，这些疾病包括神经退行性疾病[6]、代谢性疾病[7]以及癌症[8]、[9]、[10]。鉴于其关键作用，全面解析表面组对于理解细胞功能和疾病机制至关重要[11]。然而，传统的样本制备方法，如基于密度梯度离心分离的技术，会不可避免地破坏细胞的天然环境，导致蛋白质不稳定、非特异性解离以及关键表面蛋白的丢失。因此，要准确分析表面组，就需要采用原位分析方法，以保持蛋白质的天然表达模式和功能状态。
基于化学标记的技术已成为原位分析表面组的有效手段。具体而言，人们已经开发出了多种功能化的探针，这些探针配备了吡啶盐活化酯[12]、N-羟基琥珀酰亚胺酯[13]以及邻苯二甲醛[14]、[15]等活性基团，可用于标记活细胞表面暴露的伯胺，主要针对CSPs中的赖氨酸残基。此外，还有细胞表面捕获技术[16]、[17]以及代谢标记方法[18]、[19]，它们能够实现细胞表面糖蛋白的原位标记。碘乙酰胺也被证明是一种可靠的化学试剂，可用于标记细胞表面暴露的半胱氨酸残基[20]。不过，这些方法都存在一定的偏差，导致表面组的覆盖范围有限，而且由于活性探针的存在，反应会持续进行，这就难以实现精确的时间控制，增加了出现假阳性结果的几率。
酶催化或光催化的邻近标记策略可以通过可控的方式生成活性中间体，从而实现蛋白质的原位标记。通过限制标记范围并实现精确的时间控制，这些方法提高了标记的可控性，增强了标记的特异性，同时减少了假阳性信号的出现[21]、[22]、[23]。因此，与细胞膜结合的酶或光敏剂在实现更高时空精度的表面组定位方面具有巨大潜力。目前，将光敏剂定向输送到细胞膜上的常用方法是通过胆固醇[26]、[27]或DPPE[28]等脂质锚定剂，利用它们与磷脂双层的疏水作用和静电相互作用。这种非共价定位机制对膜流动性极为敏感，容易导致光敏剂通过内吞作用进入细胞内部[29]、[30]、[31]，进而影响细胞表面标记的精确度，导致细胞内其他蛋白质也被标记，且标记效率也不稳定。
为了解决这个问题，我们受到了异硫氰酸酯在适合蛋白质生物偶联的温和、生物相容性条件下能与含赖氨酸的蛋白质形成稳定加合物这一特性的启发[32]、[33]、[34]，同时考虑到细胞表面蛋白上的许多赖氨酸残基处于溶剂可及状态，便于进行化学标记[15]，于是我们开发出一种新型的光活化探针——异硫氰酸酯-吡啶盐偶联的乙酰化二溴荧光素（SCN-Py-AcDBF）。这种新型探针不仅能有效地定位在细胞表面，还能通过与CSPs形成共价键来限制自身的移动。这种共价限制大大减少了光敏剂的内吞和扩散，从而提高了表面组分析的覆盖率和准确性，为深入研究CSPs提供了更为可靠的工具。与那些依赖非共价相互作用的光敏剂或没有定位功能的光催化剂相比，新方法实现了更高的CSP识别覆盖率，为CSPs的功能表征提供了重要数据。
章节节选
荧光成像分析
将HeLa细胞与SCN-Py-AcDBF（10 μM）在37℃的黑暗环境中孵育2小时或6小时，然后用PBS冲洗，再加入核染料Hoechst 33342（15 μg/mL）染色10分钟。冲洗后，使用共聚焦显微镜在488纳米（SCN-Py-AcDBF）和549纳米（DiI）通道下获取荧光图像，以此判断蛋白质在细胞内的定位情况。
为了检测细胞表面标记的特异性，将HeLa细胞与SCN-Py-AcDBF（10 μM）孵育6小时，用PBS冲洗，然后处理含有3-EA的HBS缓冲液
空间限定型光敏剂的设计与合成
鉴于SCN与伯胺之间能够发生稳定且温和的反应，我们认为它非常适合用于将光敏剂稳定地固定在细胞表面。新型探针SCN-Py-AcDBF的结构及其关键的合成步骤如图1所示。在该设计中，我们采用了生物相容性良好且特性已明确的二溴荧光素作为光敏剂，这样就能在温和的条件下通过单线态氧1O2的生成来实现有效的光控邻近标记
结论
总之，我们开发出一种新型的光活化标记探针SCN-Py-AcDBF，旨在克服传统光敏剂在表面组分析中存在的核心问题，即由于非共价膜定位作用导致的探针被细胞内吞。吡啶盐基团增强了光敏剂通过静电作用定位在细胞膜上的能力，而异硫氰酸酯功能则使得光敏剂能够以温和的方式共价固定在细胞表面蛋白上，从而实现受时间和空间控制的氧化标记。这一策略提升了
CRediT作者贡献说明
陈乐：实验研究。曾宇琪：验证、方法设计、实验研究。江倩倩：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、可视化处理、方法设计。张玉魁：指导工作。杨开光：指导工作。张晓哲：资金筹集。王赫：论文撰写——审阅与编辑。张丽华：论文撰写——审阅与编辑、指导工作、概念构思。江波：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、指导工作、概念构思
致谢
本研究得到了“新发重大传染病防控——国家科技重大专项”（编号2025ZD01905500）、中国国家重点研发计划（编号2023YFA0913902）、“国家自然科学基金”（编号22474136和22074140）、大连化学物理研究所创新基金（编号DICP I202316）的支持。同时还得到了中国科学院大连化学物理研究所自主经费以及大连医科大学第二医院（DMU-2&DICP UN202405）的资助。
