转录因子PmRunt调控合浦珠母贝生长与生物矿化的机制研究

《Aquaculture Reports》：Regulation of growth and biomineralization by transcription factor PmRunt in Pinctada fucata martensii

　　

Runt家族转录因子在进化上高度保守。尽管其在脊椎动物内骨骼形成中的作用已确立，但其在无脊椎动物外骨骼生物矿化中的功能尚不清楚。本研究表明，PmRunt作为合浦珠母贝（Pinctada fucata martensii）中唯一的Runt同源基因，是生物矿化和免疫的双重主调控因子。PmRunt基因敲低通过破坏离子稳态、降低碳酸酐酶（CA）活性以及逆转结晶调控因子的表达平衡，严重抑制了钙化作用与生长。转录组学分析显示，外套膜中PmRunt表达的干扰导致Ca²⁺和HCO₃^-的离子转运与吸收紊乱、蛋白质/膦酸酯合成以及细胞增殖与分化障碍。CUT&Tag分析揭示PmRunt可能直接结合RUNX2/3型基序（GAAACC）以调控关键基因（包括基质蛋白、细胞周期蛋白和矿化相关基因），同时与免疫相关基因的关联可能反映了其在驻留血细胞中的祖先RUNX1样功能。这些发现阐明了生物矿化的保守遗传通路，并为骨骼系统深层进化同源性的研究提供了新见解。

## 一、研究背景与问题提出

在动物进化历程中，骨骼系统作为核心支撑结构，其形态发生与稳态维持是发育生物学的关键问题。陆生脊椎动物依赖内骨骼系统支撑躯体并抵抗机械损伤，而海洋无脊椎动物则通过外骨骼保护软组织。对于双壳贝类而言，其外骨骼（贝壳）的发育、生长与生物矿化本质上是外套膜组织细胞精确调控的产物，涉及定向细胞增殖、分化及特定细胞外基质（ECM）组分的合成与组装。然而，驱动这一复杂程序的分子机制，尤其是在转录调控层面的机制，仍有待深入探索。

Runt结构域转录因子家族在动物界高度保守，在细胞命运决定中发挥核心作用。脊椎动物中该家族三个成员（RUNX1、RUNX2、RUNX3）具有功能分化和协同作用：RUNX1是造血干细胞生成和T淋巴细胞发育的关键调控因子；RUNX2可调控成骨细胞分化和骨骼发育，直接调节I型胶原和骨钙素等一系列成骨基因；RUNX3则参与神经系统发育、免疫调节和胃肠上皮分化。在无脊椎动物特别是软体动物中，生物矿化调控系统也涉及多种转录因子，如SMAD、AP-1和Sp8/9等已证实参与贝壳形成。值得注意的是，在合浦珠母贝中已鉴定出Runt的同源基因PmRunt，前期研究表明其表达与珍珠层形成及个体生长密切相关，敲低后导致珍珠层结构紊乱和生长迟缓，提示RUNT家族在无脊椎动物外骨骼构建中可能发挥古老且保守的调控作用。

与脊椎动物中功能分化的RUNX1、2、3不同，作为单拷贝基因的PmRunt可能承担多种角色，早期研究已暗示其不仅参与钙化过程，还可能涉及免疫调节。但仍不清楚PmRunt在珍珠贝中的识别基序特征，以及其是否能像脊椎动物对应物那样直接与钙化及免疫相关基因相互作用，或此类相互作用如何影响外套膜组织内的细胞分化。为此，研究人员利用染色质免疫共沉淀技术的新发展——CUT&Tag技术，首次应用于合浦珠母贝，旨在精确绘制PmRunt蛋白的全基因组DNA结合图谱，识别其直接调控的顺式作用元件和靶基因，并结合长期PmRunt干扰实验，系统阐明PmRunt通过特定分子通路网络调控外套膜细胞功能、驱动贝壳生物矿化的完整机制。

## 二、关键技术方法

本研究所用关键方法包括：从广东湛江流沙湾获取平均壳长5-6 cm的合浦珠母贝样本，经循环海水预适应后开展实验；采用RNA干扰（RNAi）技术进行为期4周的PmRunt基因沉默，每周注射dsRNA溶液；通过转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因；运用CUT&Tag技术在全基因组水平鉴定PmRunt蛋白的结合位点，使用抗RUNX1抗体捕获PmRunt-DNA复合物，经过Tn5转座酶切割、文库构建及Illumina高通量测序，结合MEME Suite进行de novo基序分析；同时测定碳酸酐酶（CA）和Ca²⁺-ATP酶活性以评估生物矿化状态。

## 三、研究结果

### 3.1 PmRunt影响钙离子吸收与CaCO₃沉积

PmRunt敲低显著抑制了CA和Ca²⁺-ATP酶的活性，表明PmRunt干扰破坏了碳酸氢根离子供应和细胞钙处理能力，而这对于生物矿化至关重要。分子水平分析显示，结晶抑制相关基因PmTyr-4上调，而结晶促进相关基因PmPif下调，表明钙碳酸盐沉积受到系统性抑制，与壳形成抑制效应一致。

### 3.2 PmRunt对生物矿化和壳生长的影响

通过4周RNAi后的转录组测序，共鉴定出1111个差异表达基因（DEGs），其中574个上调、537个下调。KEGG通路分析表明，PmRunt参与矿物质吸收、TNF信号通路、甲状旁腺激素合成/分泌与作用、膦酸酯与膦酸代谢以及ECM-受体互作等通路。GO富集分析显示，DEGs主要涉及溶质：钠同向转运体活性、微丝马达活性、丝氨酸型内肽酶抑制物活性、碳水化合物结合及胞外空间等功能。

在离子转运与Ca²⁺、HCO₃^-吸收方面，PmRunt抑制导致关键转运基因表达下降，包括Slc26a5（HCO₃^-外排）、Slc9a3（H⁺内流/pH调节）和Slc34a（磷酸盐吸收），功能富集于钠同向转运体活性和胞外空间，导致矿化前沿Ca²⁺、PO₄^3-和HCO₃^-供应不足，微环境稳态被破坏。

在细胞增殖及蛋白质/膦酸酯合成方面，磷酸代谢通路（如phnZ）下调可能破坏ATP、核酸和磷脂等基本生物分子的合成，限制矿化所需的物质和能量底物；微丝马达活性降低可能影响囊泡运输和细胞分裂，碳水化合物结合能力下降则可能破坏细胞外基质模板的稳定性。

在细胞分化调控因子方面，TNF信号通路和ECM-受体互作相关基因发生改变，凋亡抑制因子birc7-a下调而凋亡执行因子CASP8上调，表明细胞对外部信号的响应受损，向矿化表型的分化受阻；基质完整性基因FREM1_2下调而胶原相关基因上调，提示ECM重塑失调，结构稳定性减弱并伴有异常纤维化沉积，共同形成不利于有序矿化的异常微环境。

此外，尽管大多数钙调蛋白/钙离子、碳酸氢盐和ATP酶相关基因因补偿反应而上调，但关键Ca²⁺-ATP酶激活剂CALM4下调，可能是酶活性降低的重要原因；基质蛋白、几丁质酶、酪氨酸酶、外套膜功能相关因子及珍珠层相关组分（包括PmPif）等基因则呈现上调和下调并存的广泛转录扰动。

### 3.3 PmRunt的CUT&Tag测序分析

PmRunt与小鼠Runt相关转录因子的序列比对显示与RUNX1具有高度同一性（>70%）。系统发育分析显示脊椎动物与无脊椎动物RD蛋白明显分离，软体动物Runt蛋白形成独立分支，脊椎动物RUNX1蛋白形成良好支持的单系群。

CUT&Tag实验获得高质量数据：清洁读对保留率99.99%，基因组比对率69.03%，MAPQ≥30的比对读占62.00%，无细胞器污染，最终获得284万有效独特读对，鉴定出4379个显著结合峰。峰值分布显示启动子区域富集明显：核心启动子区（≤1 kb）占4.17%，上游启动子区间（1-5 kb）合计约5.5%，第一外显子占3.3%，且丰度在转录起始位点（TSS）周围增加，随距离增加而降低，表明PmRunt主要结合基因的调控必需区域，核心功能最可能是调控转录起始。

功能富集分析表明，PmRunt靶基因在KEGG层面富集于PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路和细胞黏附分子（CAMs）通路，这些通路共同构成调控细胞增殖、分化和命运决定的核心信号网络；GO分析则显示靶基因富集于染色质组装/去组装、核小体组装与组织、DNA包装与构象改变以及核受体活性等核心核调控过程，直接与染色质结构的动态重塑和基因转录的可及性相关。

De novo基序分析揭示PmRunt结合基序为GAAACC，与脊椎动物RUNX2/3及果蝇Runt共享AAACC核心，但与哺乳动物RUNX1的特征性TGTGG核心不同，表明PmRunt优先识别RUNX2/3型基序。

### 3.4 RNA-seq与CUT&Tag交叉分析鉴定对生物矿化和生长的调控

通过筛选启动子、3'UTR或第一外显子区有峰值的683个基因，与转录组差异表达基因取交集获得24个高置信度核心靶基因。PmRunt RNAi后，免疫相关基因中PGRP（肽聚糖识别蛋白）和ABCC1（ATP结合盒C亚族成员1）下调，而SUMO（小泛素样修饰物）、KPNB1（核转运蛋白β1亚基）、凝胶溶蛋白和Ig样结构域基因上调；关键生物矿化相关基因包括hoxb4a（同源框B4a）、Slc34a2（溶质载体家族34成员2）和VIL1（绒毛蛋白1）均显著上调，表明PmRunt正常情况下可能抑制这些基因，其缺失后的去抑制与矿化和生长缺陷表型一致，说明PmRunt通过抑制整合发育、离子稳态和细胞结构的多层网络来协调壳形成。

## 四、讨论与结论

研究人员深入讨论了PmRunt作为合浦珠母贝中唯一Runt家族同源基因的双重功能特性。长期干扰实验证实，持续抑制PmRunt触发多种矿化相关指标的显著改变：CA和Ca²⁺-ATP酶活性下降，矿化抑制因子PmTyr-4表达上调而矿化促进因子PmPif异常下调，这些分子和生化改变共同指向壳形成抑制。与先前8天短期干扰实验相比，4周长期干扰能更全面揭示持续PmRunt抑制对壳生长的后果，包括壳长、壳高、壳宽和珍珠层厚度的显著降低。

PmRunt通过多层次调控网络影响生物矿化：在离子供应层面，直接损害离子转运网络导致矿化前沿必需离子供应不足；在细胞构建层面，破坏磷酸代谢和细胞骨架动态，损害基本生物合成过程、囊泡运输和ECM组装；在分化调控层面，扰乱TNF等信号通路和胞外微环境重塑，阻止细胞向矿化表型分化。CUT&Tag分析揭示PmRunt结合的靶区域显著富集于PI3K-Akt、Hippo等保守信号通路及染色质重塑功能，将其定位为细胞增殖、分化和命运决定的中心调控因子。

特别值得关注的是PmRunt的功能双重性。尽管使用抗RUNX1抗体进行CUT&Tag，但其优先结合RUNX2/3型GAAACC基序，在矿物质化能力细胞中主要调控矿化相关基因网络；同时在外套膜组织的驻留免疫细胞中检测到免疫相关通路（NF-κB、TNF、TLR）和基因（PGRP、SUMO等）的弱富集，可能反映祖先RUNX1样免疫功能。这种由单一转录因子在不同细胞群体中协调矿化和免疫功能的现象，揭示了Runt家族在骨骼系统进化中的古老起源和功能保守性。与脊椎动物通过基因复制实现RUNX1（造血/免疫）和RUNX2/3（骨发生/矿化）功能分化不同，合浦珠母贝保留的单拷贝PmRunt以多效性方式同时调控两个过程，为探索单一多效转录因子如何表观遗传协调免疫和矿化程序提供了重要模型。

**研究结论**：本研究鉴定PmRunt为合浦珠母贝中唯一的Runt家族同源基因，证实其在贝壳生物矿化中的核心作用。4周PmRunt敲低通过破坏离子稳态、降低碳酸酐酶活性以及改变结晶调控因子的表达平衡，严重损害钙化和生长。整合转录组学和CUT&Tag分析进一步表明，PmRunt通过RUNX2/3样调控特征（GAAACC基序富集）调节生物矿化基因，其与免疫相关基因的关联则提示可能的祖先RUNX1样功能。这些发现确立了PmRunt作为连接生物矿化和免疫的关键调控因子地位，为骨骼调控程序的保守进化提供了深入见解。