抗癌硫醇桥联锰(I)羰基复合物与无转铁蛋白之间分子结合机制的阐明：热力学与结构学视角

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Elucidation of the molecular binding mechanism of an anticancer thiolato-bridged manganese(I) carbonyl complex with apotransferrin: Thermodynamic and structural insights

　　

阿斯瓦西·阿尼尔|迪克莎·特里帕蒂|苏巴什丽·苏巴斯米塔·纳亚克|拉马达斯·克里希纳|乌迪特·库马尔|巴拉·马尼马拉兰|纳塔拉詹·萨克蒂维尔

印度本地治里邦卡拉佩特，本地治里大学生命科学学院生物技术系，邮编605014

摘要

我们通过生物物理和计算方法研究了抗癌硫醇桥连锰(I)羰基金属环(S-MnC)与无铁转铁蛋白(ApoTf)的分子结合机制。紫外-可见光谱分析显示出现显色性增强现象，表明ApoTf与S-MnC之间存在相互作用。荧光淬灭实验显示，随着温度升高（300 - 312 K），斯特恩-沃尔默常数和淬灭速率常数均增加，证实了动态淬灭现象的存在。时间分辨荧光实验显示，荧光平均寿命从2.67纳秒降至2.05纳秒。通过弗斯特共振能量转移(FRET)计算得到的ApoTf（供体）与S-MnC（受体）之间的距离表明，二者之间的能量转移效率很高，有效平均接触距离为3.21纳米，这一数值与动态淬灭过程中瞬时碰撞相互作用的特征相符。热力学分析结果显示ΔH?和ΔS?为正值，而ΔG?为负值，说明这种结合是熵驱动的，通过疏水相互作用自发形成。圆二色光谱分析显示蛋白质的二级结构仅有轻微变化。分子对接实验表明S-MnC会结合在转铁蛋白的N叶铁结合位点，通过氢键与Y95位点（一个Fe³⁺配位残基）结合，同时还存在多种疏水相互作用，预测其结合能为-10.2千卡/摩尔。S-MnC能与ApoTf在铁离子结合部位附近形成稳定的、热力学上稳定的复合物，这说明可以利用转铁蛋白介导的内吞作用作为该化合物在细胞内的输送机制。

引言

锰(I)羰基复合物近年来被视为一类极具潜力的治疗药物，它们不仅可作为潜在的细胞毒性药物，还能作为一氧化碳释放分子（CORMs），从而调节细胞信号传导并诱导癌细胞凋亡[1]。此外，金属基药物的疗效还取决于它们与核DNA的相互作用，以及其在血液中的运输和分布情况[2]、[3]、[4]。研究表明，血清蛋白会与顺铂等铂基药物结合，进而影响这些药物的治疗效果和在体内的分布情况[5]、[6]。通过受体介导的内吞作用，药物与无铁转铁蛋白（ApoTf）结合，不仅能提升药物功效，还能降低其对正常细胞的毒性。ApoTf是转铁蛋白的无铁形式，是一种80千道尔顿的重瓣状糖蛋白，由679个氨基酸组成，分为N端叶和C端叶（见图S1）。

当铁离子与ApoTf结合后，它的构象会从开放状态发生显著变化，转变为闭合状态，这一转变对于转铁蛋白受体1（TfR1）识别该蛋白以及后续的受体介导内吞过程至关重要[7]。由于快速分裂的细胞对铁的需求较高，许多恶性细胞表面，包括结肠癌细胞，都会过度表达转铁蛋白受体（TfR1）[8]。这一过度表达为“特洛伊木马”策略提供了可能，即让金属复合物与转铁蛋白结合，再通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞内部[9]。虽然已有研究描述了顺铂与转铁蛋白的相互作用[7]，但非铂基金属复合物，尤其是基于锰(I)羰基的复合物与ApoTf的结合特性仍缺乏相关研究。对已发表的ApoTf结合研究进行综述后可以发现，与已成熟的铂基和钌基药物相比，能够释放一氧化碳的金属复合物在相关研究方面还存在很大差距（见表1）。

为了寻找可用于生物医学领域的能释放一氧化碳的金属羰基复合物，我们近期报道了一系列硫醇桥连锰(I)金属环化合物[21]。其中，含有柔性二乙二醇二酯连接基团的([{(CO)₃Mn(μ-SC₆H₅)₂Mn(CO)₃}(μ-4-pyridine carboxylic acid diethylene glycol diester (pcadgd))]) (S-MnC)化合物，因其抗癌性能以及与DNA和人血清白蛋白的结合潜力，受到了我们的重点研究[21]、[22]。S-MnC由面式Mn(CO)₃核心、双齿配体4-吡啶甲酸二乙二醇二酯（pcadgd）以及苯硫醇基团组成，在双核结构框架中三者的比例分别为2:1:2。每个锰(I)金属中心都处于扭曲的八面体环境中，周围有三个端基羰基以面式排列，还有一个吡啶配体以及两个苯硫醇基团。引入具有柔性结构的二乙二醇二酯功能化吡啶配体（pcadgd）后，不仅提升了该化合物的溶解度，还增强了其与靶分子的结合能力，提高了其稳定性，并使得S-MnC在生理条件下能够自发释放一氧化碳。该化合物在黑暗条件下的空气中较为稳定，但对光敏感，可溶于极性有机溶剂中[21]。通过紫外-可见光谱、红外光谱、电喷雾质谱以及核磁共振波谱等技术获得的表征数据与我们之前报道的同类化合物的结果高度一致[21]。我们在DMSO溶剂中对该化合物的稳定性进行了长达48小时的测试，发现它在室温下的黑暗环境中，无论是处于普通状态还是缓冲状态下，都保持稳定。我们还研究了S-MnC对多种癌细胞系的抗癌活性，这些癌细胞系包括肺癌A549细胞、结肠癌HCT-15细胞、宫颈癌HeLa细胞、卵巢癌SKOV-3细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、胰腺癌PANC-1细胞、前列腺癌PC-3细胞以及正常人类胚胎肾细胞HEK-293细胞[21]、[22]。与参考化合物顺铂及其前体分子相比，S-MnC在更低浓度下就展现出了更好的抗癌效果[21]、[22]。在本研究中，我们重点分析了该化合物的抗癌机制，以及它与目标分子相互作用的原理。该化合物的富电子芳香核心以及烷氧基连接基团中的氧原子，可以通过氢键、CH-π作用以及ππ非共价相互作用与目标分子形成主客体体系[21]。尽管人们越来越关注锰(I)羰基复合物作为兼具细胞毒性及一氧化碳释放功能的双重功能物质，但它们与ApoTf这类血清蛋白的相互作用目前几乎还未被研究过（见表1）。本研究在我们之前关于S-MnC的研究基础上，首次对其与ApoTf的结合行为进行了全面的光谱学、生物物理学以及计算机模拟分析，从而明确了该化合物的结构特征与其通过受体介导途径靶向肿瘤的能力之间的内在联系。

章节节选

材料

所使用的试剂（Himedia品牌）均为分析级产品。无铁转铁蛋白和顺铂则购自Sigma Aldrich公司。无铁转铁蛋白的浓度是通过在λ 280纳米波长处进行光谱测定得出的，其摩尔吸光系数为92,300 M^-1 cm^-1 [19]。

化合物合成与细胞毒性

该化合物([{(CO)₃Mn(μ-SC₆H₅)₂Mn(CO)₃}(μ-4-pyridine carboxylic acid diethylene glycol diester (pcadgd))]) S-MnC（见图1）是由Mn₂CO₁₀、二苯基二硫化物以及4-吡啶甲酸二乙二醇二酯共同合成而成的

S-MnC作用下ApoTf的紫外-可见光谱变化

ApoTf的紫外-可见光谱在λ 210纳米处有一个较强的吸收峰，在λ 280纳米处有一个较弱的吸收峰，这些吸收峰主要是由芳香族氨基酸残基的π - π*跃迁产生的，对应于蛋白质的天然构象。S-MnC加入ApoTf后，λ 280纳米处的吸收峰强度从1.15上升至1.52吸收单位（见图2插图，波长范围250-300纳米），而顺铂则使该吸收峰强度上升至1.27吸收单位。不过，与S-MnC复合物相比，顺铂引起的吸收峰强度上升幅度要小，由此可以确定两者作用的强度顺序

讨论

在含锰基CORM（S-MnC）的ApoTf紫外-可见光谱中，λ 280纳米处出现的显色性增强现象，是蛋白质结构发生改变的重要标志。在转铁蛋白的生化过程中，当Fe³⁺等金属离子与ApoTf结合后，蛋白质会从“开放”的无铁形态转变为类似“闭合”的全铁形态，这一过程中由于酪氨酸残基（如Y95、Y188）的参与，会使λ 280纳米处的吸光度上升，这一现象已有较多研究报道[32]。光谱增强程度的大小

结论

本研究表明，S-MnC能够与无铁转铁蛋白（ApoTf）形成一种自发的、热力学上稳定的复合物，这一结论得到了温度依赖性荧光淬灭实验以及范特霍夫方程分析的支持。随着温度的升高，该复合物的结合常数K_sv和k_q都会增大，同时荧光寿命也会缩短，这些现象都表明该复合物的结合主要属于动态淬灭机制，这与顺铂的结合机制不同，顺铂会导致结合常数随温度升高而下降。圆二色光谱和傅里叶变换红外光谱分析结果也

CRediT作者贡献说明

阿斯瓦西·阿尼尔：负责撰写原始稿件、验证实验结果、进行正式分析以及数据整理工作。迪克莎·特里帕蒂：负责验证实验结果以及进行正式分析。苏巴什丽·苏巴斯米塔·纳亚克：负责软件操作、正式分析以及数据整理工作。拉马达斯·克里希纳：负责验证实验结果、项目监督以及软件相关工作。乌迪特·库马尔：负责验证实验结果、资源协调、实验开展以及概念构思工作。巴拉·马尼马拉兰：负责项目监督、资源协调、实验开展以及概念构思工作。纳塔拉詹·萨克蒂维尔：负责撰写审稿和编辑稿件、验证实验结果、项目监督以及项目管理工作，

利益冲突声明

各位作者声明不存在任何利益冲突

利益冲突声明

? 作者们声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

作者们感谢本地治里大学生物技术系为本研究提供的研究设施、资金支持以及全方位的帮助。同时，我们也非常感谢本地治里大学化学系的舒鲁蒂·维尔玛在化合物制备过程中给予的宝贵协助。此外，作者们还要衷心感谢本地治里大学中央仪器设施部门，正是他们提供了对本研究至关重要的光谱数据。