《Biochemical and Biophysical Research Communications》：MicroRNA-300-3p Promotes Cardiac Hypertrophy by Modulating the ACOX-1/GPX4 Pathway
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心脏肥大（cardiac hypertrophy, CH）是心脏重构及向心力衰竭进展过程中的关键病理过程。阐明其潜在分子机制对于开发新型治疗策略至关重要。微小RNA（microRNAs, miRNAs）在心血管疾病中发挥关键调控作用；然而，它们在CH中的具体参
心脏肥大（cardiac hypertrophy, CH）是心脏重构及向心力衰竭进展过程中的关键病理过程。阐明其潜在分子机制对于开发新型治疗策略至关重要。微小RNA（microRNAs, miRNAs）在心血管疾病中发挥关键调控作用；然而，它们在CH中的具体参与机制仍未完全明确。本研究提示，miR-300-3p通过ACOX1/GPX4通路调节血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）诱导的CH。在功能上，miR-300-3p直接靶向ACOX1，导致其下调并随后增强铁死亡（ferroptosis）。过表达ACOX1可逆转这些效应。在机制上，由DNMT1介导的miR-300-3p启动子区低甲基化升高了miR-300-3p表达，并促进了Ang II诱导的肥大反应。此外，ACOX1通过激活GPX4信号通路发挥抗肥大作用。总之，DNMT1调控的启动子低甲基化增强了miR-300-3p表达，抑制了ACOX1，并在Ang II诱导的CH中促进了铁死亡。miR-300-3p/ACOX1/GPX4轴揭示了CH中新的分子通路，并明确了潜在的治疗调控因子。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
心脏肥大（cardiac hypertrophy, CH）是心脏对压力超负荷的代偿性反应，但持续的病理性肥大可导致心力衰竭。目前，虽然已知微小RNA（microRNAs, miRNAs）在心血管疾病中发挥重要调控作用，但其在CH中的具体分子机制尚未完全阐明。酰基辅酶A氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1, ACOX1）是脂肪酸β氧化的关键酶，其功能缺失可导致心肌细胞代谢紊乱和氧化应激增强，然而ACOX1在CH中的确切角色仍不明确。此外，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖的脂质氧化细胞死亡方式，在心血管疾病中的作用日益受到关注，但其在CH中的调控机制尚未被完全解析。因此，研究人员旨在探索miRNA在CH中的调控作用，并揭示其与ACOX1和铁死亡通路的关联。
**研究概述**
研究人员通过体内外实验，发现miR-300-3p在血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）诱导的CH中显著上调，并证实其通过直接靶向ACOX1的3′-非翻译区（3′-UTR）抑制ACOX1表达，进而促进铁死亡。机制上，DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1, DNMT1）介导的miR-300-3p启动子低甲基化是其上调的关键表观遗传调控机制。进一步研究发现，ACOX1通过激活谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）信号通路发挥抗肥大和抗铁死亡作用。该研究首次阐明了DNMT1/miR-300-3p/ACOX1/GPX4轴在病理性CH中的调控网络，为治疗CH及预防心力衰竭提供了新靶点。论文发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》。
**主要技术方法**
研究使用了以下关键技术：miRNA微阵列芯片（miRNA microarray）筛选差异表达miRNA；生物信息学数据库（miRBase、microRNA.org、miRcode）预测靶基因；双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）验证miR-300-3p与ACOX1 3′-UTR的直接结合；定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测基因和蛋白表达；靶向DNA甲基化测序分析启动子甲基化水平；透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构；流式细胞术检测活性氧（ROS）水平；组织学染色（HE、Masson、WGA）及免疫荧光评估心脏结构、纤维化和心肌细胞大小。动物实验使用雄性C57BL/6J小鼠（来自宁夏医科大学实验动物中心），通过皮下植入微型渗透泵持续输注Ang II建立CH模型。
**研究结果**
**1. Ang II induces CH and dysfunction**
通过超声心动图、组织学染色、ELISA及qRT-PCR等分析，研究人员证实Ang II处理4周后，小鼠心脏功能下降（左心室射血分数EF和短轴缩短率FS降低），心脏重量/体重指数（HWI）升高，血浆pro-BNP水平增加，心肌组织ANP和BNP表达上调，心肌细胞横截面积增大，并出现心肌纤维化；体外H9C2细胞经Ang II刺激后同样表现出肥大标志物上调，表明CH模型构建成功。
**2. Upregulation of miR-300-3p in Ang II-induced pathological CH**
miRNA微阵列分析显示，Ang II处理H9C2细胞后，34个miRNA上调、44个下调，其中miR-300-3p显著升高。KEGG和GO分析预测其靶基因富集于氧化应激、铁死亡和脂肪酸代谢等通路。qRT-PCR验证了Ang II处理后H9C2细胞及心脏组织中miR-300-3p表达均上调，提示其参与CH进程。
**3. Hypomethylation of the miR-300-3p promoter mediates its upregulation in pathological CH**
生物信息学发现miR-300-3p启动子区存在CpG岛，靶向DNA甲基化测序显示Ang II组该区域甲基化水平降低。Ang II处理显著抑制DNMT1（而非DNMT3a或DNMT3b）的mRNA和蛋白表达。利用siRNA敲低DNMT1后，miR-300-3p表达进一步升高，证实DNMT1介导的启动子低甲基化是miR-300-3p上调的机制。
**4. miR-300-3p directly targets ACOX1 by binding to its 3'-UTR**
构建ACOX1 3′-UTR野生型（WT）和突变型（Mut）双荧光素酶报告质粒，与miR-300-3p mimic共转染HEK-293T细胞后，WT组荧光活性显著降低，而Mut组无变化。在H9C2细胞中，miR-300-3p mimic抑制ACOX1 mRNA和蛋白表达，而miR-300-3p inhibitor则上调ACOX1，验证了ACOX1是miR-300-3p的直接靶基因。
**5. ACOX1 plays a crucial role in Ang II-induced ferroptosis**
Ang II处理后，心脏组织和H9C2细胞中ACOX1蛋白表达均降低。过表达ACOX1可上调铁死亡相关蛋白GPX4和XCT，同时下调COX2。TEM显示Ang II处理导致线粒体萎缩、嵴减少和膜破裂等典型铁死亡形态特征；ROS检测也证实Ang II促进细胞内ROS积累。综上，ACOX1下调加剧了Ang II诱导的铁死亡。
**6. GPX4-mediated ferroptosis plays a key role in CH**
通过siRNA敲低GPX4表达后，Ang II刺激的H9C2细胞肥大标志物ANP和BNP表达进一步升高，心肌细胞表面积增大，细胞内Ca
2+水平增加。表明GPX4介导的铁死亡调控在CH发展中起关键作用。
**讨论与结论**
本研究发现了一个新的表观遗传调控机制：Ang II通过抑制DNMT1表达导致miR-300-3p启动子低甲基化，上调miR-300-3p，后者直接靶向ACOX1并抑制其表达，从而促进铁死亡并加重心肌细胞肥大。而ACOX1过表达可通过激活GPX4通路减轻铁死亡和肥大反应。该研究首次揭示了DNMT1/miR-300-3p/ACOX1/GPX4信号轴在病理性CH中的功能，为基于铁死亡调控的心脏肥大治疗提供了新靶点。结论翻译如下：在本研究中，研究人员阐明了DNMT1、miR-300-3p、ACOX1和GPX4在Ang II诱导的心脏肥大中的功能相互作用。Ang II处理降低DNMT1表达，导致miR-300-3p启动子低甲基化和miR-300-3p上调。升高的miR-300-3p在转录后水平抑制ACOX1表达，从而促进铁死亡并加速心肌细胞肥大。相反，ACOX1表达增加通过调节GPX4通路减轻铁死亡并减弱肥大重构。总之，这些发现揭示了一个新的DNMT1/miR-300-3p/ACOX1/GPX4信号轴，该轴调控病理性心脏肥大过程中的铁死亡。靶向该分子通路可能代表一种有前景的治疗策略，用于预防或逆转心脏肥大及其向心力衰竭的进展。
