负载15d-PGJ2的PLGA纳米粒的制备与表征，以及用于糖尿病伤口治疗的小肠黏膜下层与纳米粒结合体的体外评估

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Formulation and characterization of 15d-PGJ2 loaded PLGA nanoparticles and in vitro evaluation of small intestinal submucosa integrated with nanoparticles for diabetic wound

　　

泽伊纳布·库拉巴迪|尼卢法尔·塔吉普尔|玛丽亚姆·鲁哈尼|马苏德·索莱曼尼|赛义德·海达里·凯谢尔|阿扎姆·拉希米|巴哈雷·普尔贾巴尔|法尔扎内·萨埃迪·兰迪

伊朗德黑兰沙希德贝赫什蒂医学科学大学医学高级技术学院组织工程与应用细胞科学系

摘要：

糖尿病足溃疡是一种慢性且往往难以愈合的伤口。由于持续的炎症和感染，其治疗面临极大挑战，因此需要探索创新策略以找到更有效的治疗方法。本研究旨在开发一种具有抗炎特性的可生物降解的、模拟细胞外基质的创面敷料，该敷料能够控制炎症，同时促进伤口区域的细胞增殖与迁移。研究将抗炎药物前列腺素J2（15d-PGJ2）封装在PLGA纳米粒子中。含有15d-PGJ2的纳米粒子的平均水动力尺寸和Zeta电位分别为261.6纳米和-14.3毫伏，多分散指数低于0.2。药物的包封效率为96.7%，载药量为18.5%，其中50%的药物在240分钟内释放。为了评估药物毒性并确定纳米粒子的安全剂量，研究人员进行了包括MTT检测和划痕试验在内的细胞实验。猪小肠黏膜下层组织经过EDC/NHS交联后与纳米粒子结合。这些改良后的支架经过了包括FTIR分析、酶解作用、膨胀行为、接触角测量、机械性能评估以及细胞粘附试验在内的体外特性检测。结果显示，这些支架具有适宜的亲水性、较低的降解率、更高的机械强度，还能与成纤维细胞有效相互作用。基于其物理化学和生物学特性，携带抗炎纳米粒子的EDC交联SIS支架展现出了良好的应用前景，因此可视为治疗糖尿病伤口的理想选择。

引言

糖尿病足溃疡是糖尿病患者常见的严重并发症，往往会发展成慢性且难以愈合的感染，最终可能导致截肢[1]。大约15%到25%的糖尿病患者在 lifetime内会出现糖尿病足溃疡[2]。患有糖尿病足溃疡的糖尿病患者的5年死亡率约为30%，而发生大范围截肢后这一比例还会上升至50%以上。因此，大范围截肢后的死亡率甚至高于某些局部癌症患者的5年死亡率[3,4]。例如，有研究显示糖尿病足溃疡的5年总体死亡率为30.5%，而癌症的这一比例为31%[2]。毫无疑问，糖尿病并发症不仅会严重影响患者的生活质量和预期寿命，还会给社会带来巨大的经济负担[5]。据相关报告，全球糖尿病足溃疡治疗市场规模预计将从目前的44亿美元增长到2032年的74亿美元[2]。遗憾的是，尽管治疗策略不断进步，现有的治疗方法仍无法充分满足患者的需求，这凸显出开发创新策略的紧迫性。传统的治疗方法效果不佳，需要频繁给药。此外，许多具有抗菌和抗炎作用的药物会对细胞功能产生抑制作用。为避免这些药物带来的细胞毒性，实现药物的缓慢释放至关重要。在这方面，基于纳米粒子的递送系统因能够实现可控释放并保持持续作用，而在慢性伤口治疗中备受关注。这类系统还能保护药物免受糖尿病伤口环境的破坏，从而降低用药剂量及相关成本[6]。糖尿病伤口难以愈合的主要原因是持续的炎症状态[7]。在多种因素的影响下，M1型巨噬细胞成为这些伤口中的主导类型，持续产生促炎细胞因子。这种炎症环境又会抑制负责炎症消退和组织修复的M2型巨噬细胞的活性，因为后者可通过产生生长因子来促进组织修复[8,9]。另一方面，过度的炎症会增强基质金属蛋白酶的活性，进而导致细胞外基质的进一步降解。在这种情况下，细胞的增殖和迁移都会受到干扰，生长因子的激活和生成也会出现异常[10,11]。过度的炎症会延缓伤口从炎症期向后续的增生期的过渡[12]。因此，有效控制伤口炎症或许是研发功能性糖尿病伤口敷料的关键。

在本研究中，前列腺素15-脱氧-Δ12,14-PGJ2（15d-PGJ2）被用作创面敷料中的抗炎成分。15d-PGJ2属于环戊烯酮类前列腺素，是环氧化酶-2活性的最终产物。在炎症过程中，15d-PGJ2作为前列腺素D2的脱水终产物，在发炎组织中大量生成[13,14]。研究表明，15d-PGJ2既是过氧化物酶体增殖物激活受体γ的激动剂，又能直接抑制核因子κB的活性。因此，它可以通过激活PPARγ和抑制NF-κB来调节炎症反应[14,15]。由于该药物的分子靶点位于细胞质深处或细胞核内，再加上其脂溶性较高且扩散能力有限，因此需要合适的载体才能实现预期的治疗效果[14]。先前的研究已经表明，聚乳酸-羟基乙酸共聚物、固体脂质纳米结构以及纳米乳液都是15d-PGJ2的有效载体。PLGA是一种知名的合成聚合物，已被广泛用于药物递送系统。由于其出色的生物相容性、可生物降解性和无毒性，PLGA已获得美国食品药品监督管理局的批准[18,19]。此外，由PLGA衍生的乳酸还被发现可以通过促进血管生成、胶原合成以及吸引内皮祖细胞到伤口部位来加速伤口愈合[20]。

以细胞外基质为基础的创面敷料是伤口修复领域极具前景且发展迅速的技术方向。猪小肠黏膜下层组织就是这类材料中最成功、最实用的例子之一。除了能够模拟细胞外基质的3D结构以支持细胞活动外，SIS还富含多种有助于伤口愈合的化合物和生长因子，比如糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白、肝素、血管内皮生长因子、表皮生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子[21]。尤为重要的是，SIS可以通过诱导M2型巨噬细胞生成、调节免疫系统功能以及抑制基质金属蛋白酶的活性来减轻炎症。因此，它能为伤口尤其是糖尿病伤口创造有利的再生环境[22,23]。SIS的主要成分是胶原蛋白，由于其低免疫原性和良好的生物相容性，已被FDA批准使用[24]。

本研究的目的是开发一种含有抗炎成分15d-PGJ2的胶原蛋白基创面敷料，为糖尿病伤口的愈合提供新的治疗手段。为提升15d-PGJ2的溶解度与安全性，并确保其能够缓慢且长时间地释放，研究人员将其封装在PLGA基纳米粒子中。与以往的研究不同，本研究采用更为简单的方法将药物负载到PLGA纳米粒子中，所用材料更少，成本也更低，而且所制备的纳米粒子具有更高的包封效率和更长的释放时间。随后，这些纳米粒子又被整合到经过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺交联的SIS织物中，从而得到了具有优异性能的新型敷料。在本研究中，我们假设将药物封装在纳米粒子中，相比直接使用游离药物，可以降低对细胞的毒性，延长药物在伤口处的停留时间，并实现可控的释放动力学。此外，我们还推测，经过全面特性检测后，负载有这些纳米粒子的交联支架将具备适合用于皮肤伤口敷料的良好性能。在本研究中，我们对所制备的纳米粒子的结构特性、载药能力、释放速率以及与细胞的相互作用进行了分析。同时，也对改良后的支架的物理化学、机械性能和生物性能进行了评估。

章节节选

材料

15d-PGJ2和PLGA（75:25）购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma Aldrich Chemical Co公司。SIS则从美国印第安纳州西拉斐特的Cook Biotech公司获得。聚乙烯醇（PVA，型号为Mowiol 4-98）以及3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）则从德国的Sigma-Aldrich公司购买。EDC和N-羟基琥珀酰亚胺则由美国的Sigma-Aldrich公司提供。杜尔贝克改良伊格尔培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素以及胰蛋白酶则

纳米粒子的特性分析

为提升药物的稳定性和生物利用度，研究人员采用溶剂置换法将其封装在PLGA纳米粒子中。随后通过动态光散射法和扫描电子显微镜对所制备的纳米粒子的形态和大小进行了检测。如图1A所示，含有15d-PGJ2的PLGA纳米粒子呈球形，大小分布均匀，范围大约在60到220纳米之间。其中约80%的粒子大小在120到180纳米区间内（见图1B）。所测得的纳米粒子的平均水动力尺寸为

讨论

与以往的15d-PGJ2递送系统相比，本研究中的配方具有合成步骤更简单、性能更优异的优点。以往的研究往往需要使用多种表面活性剂或脂质辅料，才能实现64%到77%的包封效率，而本研究仅采用了PLGA、PVA和丙酮这三种组分即可达到目标。令人惊喜的是，这种简化的方法不仅实现了96.7%的更高包封效率，还带来了更持久的释放效果，仅有50%的药物在短时间内释放

结论

在本研究中，研究人员通过溶剂置换法合成了含有15d-PGJ2的PLGA纳米粒子。这些纳米粒子具有理想的物理化学性质和良好的生物相容性，同时还具备持续的释放能力。随后，研究人员将SIS织物经过EDC交联处理，再负载上15d-PGJ2-PLGA纳米粒子。经过改良的支架具有适宜的亲水性、更高的机械强度以及合适的降解速率。这些支架通过结合多种优势特性，展现了显著的协同效应

CRediT作者贡献说明

泽伊纳布·库拉巴迪：撰写原始稿件、数据可视化、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理。尼卢法尔·塔吉普尔：撰写审阅与编辑版本、项目监督、概念构思。赛义德·海达里·凯谢尔：项目管理、监督工作。法尔扎内·S·兰迪：结果验证、软件应用、方法设计、实验研究。马苏德·索莱曼尼：撰写审阅与编辑版本、项目监督、资金筹集、概念构思。阿扎姆·拉希米：数据可视化、方法设计、数据整理。玛丽亚姆·鲁哈尼：

利益冲突声明

所有作者均声明不存在可能影响本研究结果的任何财务或个人利益冲突。

资助情况

本研究完全得到了伊朗德黑兰沙希德贝赫什蒂医学科学大学医学纳米技术与组织工程研究中心的资助，项目编号为IR.SBMU.AEC.1404.043。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务或个人利益冲突。

致谢

我们衷心感谢沙希德贝赫什蒂医学科学大学的医学纳米技术与组织工程研究中心在资金支持及实验条件方面给予我们的帮助。