口腔鳞状细胞癌细胞来源胞外囊泡通过协同凝血酶形成实现非经典血小板激活

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Non-canonical Platelet activation by oral squamous cell carcinoma extracellular vesicles through cooperative thrombin formation

　　

凝集反应促进肿瘤相关死亡，且肿瘤细胞可激活血小板以释放生长因子。然而，此种激活属于非经典途径，其采用未知激动剂，且独特之处在于并非即刻发生。源自口腔鳞状细胞癌（OSCC）的人源细胞系能够以这种非典型的延迟方式激活血小板。刺激活性并非可溶性因子，而是完全来源于自发释放的胞外囊泡（EV）。EV并不含已知的血小板激动剂。相反，化学与药理学抑制剂研究表明，OSCC EV与静息血小板相互作用后，可组装外源性及共同凝血途径的复合物，并在显著延迟后生成凝血酶。新生成的凝血酶随后通过血小板PAR1凝血酶受体刺激血小板。细胞内磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）向血小板表面的转位是其关键步骤，该过程依赖其酶促氧化。OSCC EV诱导血小板聚集的延迟与磷脂酰丝氨酸表面表达的延迟相关。血小板表达产氧化剂的前肾素受体（prorenin receptor, (p)RR），而OSCC-EV则含有其前肾素配体。(p)RR以非蛋白水解方式激活前肾素酶原，阻断该相互作用的PRO20诱饵肽或抑制肾素活性均可抑制磷脂酰丝氨酸转位及血小板激活。OSCC EV可诱导延迟的血小板膜脂过氧化，而膜内自由基捕获剂Liproxstatin-1能够抑制磷脂氧化、磷脂酰丝氨酸展示及血小板激活。研究人员据此得出结论：肿瘤细胞诱导的非经典血小板激活所呈现的滞后特征，反映了一种新型的时间依赖性前凝血酶激活过程。限速步骤为膜氧化，该过程使磷脂酰丝氨酸转位至血小板表面，并继而形成首要血小板激动剂——凝血酶。

该研究发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》。凝血反应促进肿瘤血管生成与生长，合并凝血病的患者肿瘤侵袭性增强。血栓与血小板激活可辅助肿瘤发生，因受刺激血小板释放大量可溶性及脂质介质、细胞因子、多磷酸、生长因子和促纤维化因子。血小板具有运动能力，肿瘤浸润性血小板嵌合于多种肿瘤内部，参与恶性肿瘤、肿瘤发生及化疗耐药过程。因此，血小板数量减少或抗血小板干预与预后改善相关。然而，血小板与肿瘤的相关相互作用应为表观遗传性的，因为遗传多态性仅占肿瘤相关血栓风险的5%。肿瘤浸润血小板以分散的单个血管外细胞及血管内微血栓两种形式存在于多种肿瘤中。至少在上皮样口腔鳞状细胞癌中，部分肿瘤嵌合血小板已被激活，因其表达激活后特异性合成的蛋白质。凝血酶是能够完全刺激所有血小板的单一激动剂，且OSCC患者血浆中D-二聚体水平升高，标志着体内凝血酶激活。肿瘤细胞及其释放的胞外囊泡可促进凝血和血小板激活，但这仅在显著的滞后之后发生，与所有可溶性介质通过已知信号转导通路即刻刺激血小板形成鲜明对比。非经典肿瘤激动剂的本质及其延迟的基础此前未知。

研究人员发现OSCC EV不含直接血小板激动剂，而是含有无活性的前肾素酶原，该酶原与血小板前肾素受体（(p)RR）结合，从而实现首要血小板激动剂凝血酶的生成。这种非经典血小板激活及生长因子释放的延迟与延迟的膜氧化和磷脂酰丝氨酸转位相关，后者是de novo生成凝血酶所必需的。

研究人员采用的关键技术方法包括：从正常人供体新鲜分离洗涤血小板，在含有0.1%-0.2%自体乏血小板血浆的聚集仪中测定血小板聚集反应；通过超滤浓缩和超速离心分离OSCC细胞系（SCC9、SAS-H1、SAS-L1、HSC-3、FaDu）条件培养基中的胞外囊泡，并利用ZetaView进行粒径分析；采用Western blotting检测凝血酶、组织因子、前肾素、肾素、TGF-β及高分子量EGF等蛋白表达；应用Fura2-AM荧光探针进行流式细胞术检测细胞内游离Ca²⁺浓度变化；使用Annexin V-Alexa488流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸表面暴露；利用Image-iT^TM脂质过氧化BODIPY 581/591 C11探针检测膜磷脂过氧化程度；采用荧光底物法测定凝血酶酶活性；并通过多种药理学抑制剂（包括TFPI、凝血酶抑制剂、PAR1拮抗剂、肾素抑制剂及Liproxstatin-1等）进行功能验证。

研究结果部分如下：

**不同患者来源口腔鳞状细胞癌细胞系EV诱导非经典血小板聚集**：研究人员将OSCC细胞系在血清-free培养基中过夜培养，浓缩条件培养基后稀释加入新鲜分离的洗涤人血小板中。源自舌部SCC9、SASL1、SASH1、HSC3细胞系以及咽部FaDu细胞的条件培养基均可诱导血小板聚集，但存在显著延迟。与其他OSCC细胞系类似，SCC9条件培养基的量改变滞后时间但不改变聚集程度——一旦启动，聚集总是进展完全，滞后时间是唯一受浓度调控的参数。Fura2荧光检测表明，FaDu条件培养基增加血小板胞内Ca²⁺，但呈延迟性，且延迟时间取决于刺激物量而Ca²⁺积累量与之无关，表明滞后对应于延迟的Ca²⁺信号激活而非单纯凝集。超离心得EV完全富集血小板刺激活性，而EV耗竭上清无活性，证实刺激活性 exclusively 与EV相关。ZetaView分析显示SCC9 EV呈单峰分布，平均直径约99.3 nm。

**延迟血小板激活需要外源性凝血级联生成凝血酶**：SASH1、SASL1和FaDu等OSCC细胞系释放组织因子（Tissue Factor, TF）。TFPI完全 abolish SASH1培养基诱导的血小板激活，而特异性阻断内源性凝血级联FIX的aptamer AP9.3t无效；Factor Xa抑制剂Edoxaban、不可逆凝血酶活性位点抑制剂FPRCK、凝血酶活性药理学抑制剂Dabigatran及PAR1受体抑制剂Vorapaxar均可阻断血小板聚集，表明OSCC EV通过外源性和共同凝血途径生成凝血酶，再经PAR1激活血小板。Western blotting显示OSCC EV不含预加工凝血酶，但随共孵育时间延长，α-凝血酶逐渐积累；荧光底物法显示凝血酶活性约5分钟后开始出现，此后迅速加速。TFPI可抑制此过程，证明EV诱导的凝血酶形成完全依赖外源性凝血级联。

**OSCC介导血小板聚集需要肾素酶活性及磷脂酰丝氨酸转位**：Western blotting证实OSCC EV表达前肾素配体。PRO20诱饵肽阻断前肾素与(p)RR结合，抑制SCC9或SASH1 EV诱导的血小板聚集。天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin A及直接肾素抑制剂Aliskiren均可抑制OSCC EV诱导的血小板激活，后者呈浓度依赖性延迟效应。静息血小板表面几乎无磷脂酰丝氨酸，而SCC9-EV可诱导其大量暴露，Aliskiren abolish 此效应，证明肾素酶活性是促凝磷脂酰丝氨酸展示所必需的。

**Liproxstatin-1可抑制的磷脂氧化先于且是磷脂酰丝氨酸转位及SCC9 EV诱导血小板聚集所必需的**：C11-BODIPY膜脂过氧化探针显示，SCC9 EV诱导血小板膜磷脂过氧化存在明显滞后，最终呈显著的近线性增加速率。膜脂质自由基捕获剂Liproxstatin-1 abolish 此氧化而不影响基础水平。流式细胞术表明，OSCC EV增加Annexin V对磷脂酰丝氨酸的染色，Liproxstatin-1 abolish 该增加。时序分析显示，磷脂酰丝氨酸在聚集启动前开始暴露，且在aliquot 5后显著增加，与聚集启动时间吻合；Liproxstatin-1同时抑制EV诱导的磷脂酰丝氨酸展示和后续血小板聚集，确立膜过氧化是磷脂酰丝氨酸展示及血小板激活的早期必需步骤。

**OSCC EV血小板激活诱导生长因子释放**：OSCC EV刺激血小板释放生物活性高分子量EGF，此过程需要凝血酶形成，因凝血酶抑制性aptamer R9D-14t阻断聚集并抑制该释放，而其scrambled control无效。SCC9 EV还刺激蛋白水解加工后活性TGF-β的释放。

讨论部分总结：已有研究表明，III/IV期OSCC患者血浆含有升高的富含组织因子的微粒和磷脂酰丝氨酸阳性血小板，可在体外快速形成凝血酶。本研究进一步显示，晚期OSCC肿瘤细胞系释放的EV可诱导非经典、时间依赖性血小板激活，并鉴定EV中的前肾素为独特的血小板激动剂。前肾素无蛋白水解激活的胞外功能依赖于(p)RR，而(p)RR在多种细胞表达，其信号可诱导NADPH氧化酶产生ROS，进而导致膜脂过氧化。本研究发现OSCC EV通过(p)RR-前肾素轴触发血小板多不饱和脂肪酸的锐利氧化，Liproxstatin-1捕获脂质自由基可抑制此过程及后续事件。值得注意的是，血小板激活的延迟个体差异存在于延迟本身而非激活程度，激活一旦启动即全或无。磷脂酰丝氨酸在凋亡和凝血中的功能不同：凋亡细胞通过TIM4和MEG-08两步识别被清除，而凝血中的磷脂酰丝氨酸通过结合γ-羧基谷氨酸残基修饰的凝血蛋白被识别。激活血小板通过释放上百种蛋白质及EGF、TGF-β等因子促进肿瘤发生、转移和化疗耐药，本研究确立了肿瘤相关血小板为OSCC发展和转移提供支持因子的地位。

研究结论翻译：肿瘤细胞释放的EV通过(p)RR受体激活前肾素，引发膜脂过氧化、磷脂酰丝氨酸转位和de novo凝血酶生成，最终实现非经典血小板激活并释放促肿瘤生长因子；该过程的限速步骤为膜氧化介导的磷脂酰丝氨酸表面暴露，靶向此途径可能为肿瘤相关血栓及肿瘤进展提供新治疗策略。