综述：泛素超越蛋白质组：脂质、聚糖、代谢物、核酸与扩展的分子景观

《Biochemical Society Transactions》：Ubiquitin beyond the proteome: lipids, glycans, metabolites, nucleic acids, and an expanding molecular landscape

　　

泛素化是一种多功能的翻译后修饰（PTM）过程，其中小球形蛋白泛素（Ub）共价连接到底物蛋白质上，产生多样的细胞信号。虽然最初以其在蛋白酶体介导的蛋白质降解中的作用而被描述，但现在认识到泛素化是众多过程的中心调节因子，包括信号传导、运输和免疫。经典泛素化由E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）的级联反应介导，这些酶反复将泛素分子缀合到底物蛋白质的赖氨酸残基上，形成具有不同拓扑结构的多聚泛素链。该修饰被去泛素化酶（DUBs）逆转。值得注意的是，泛素系统的组分约占人类蛋白质组的7%，强调了其在生物调控中的重要性。最近的进展揭示了泛素化的广泛范围。研究人员发现泛素不仅缀合到赖氨酸，还缀合到丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸，表明其意想不到的化学灵活性。此外，泛素化可以靶向其他翻译后修饰，特别是糖基化和ADP-核糖基化（ADP-ribosylation），突出了修饰系统之间的广泛串扰。令人瞩目的是，脂质、糖类、代谢物、核酸，甚至合成小分子化合物已被鉴定为泛素化底物。几乎所有类别的分子都被泛素化靶向的假说变得越来越合理。总之，这些发现将泛素化重新定义为一个比以前认为的更为通用的修饰过程。在本篇小综述中，研究人员聚焦于非蛋白质类泛素化研究的最新进展，总结了新兴的底物类别，并讨论了阐明这一不断扩展的修饰景观的潜在机制和生理作用的关键挑战。

Introduction：泛素化是独特的翻译后修饰（PTM），修饰物为小型蛋白泛素（Ub）。泛素化通过三类酶级联进行：泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）。E1以ATP依赖方式激活Ub并转移至E2；E3连接酶识别底物并介导Ub转移，包括RING型、HECT型和RBR型等。人类基因组编码约672种高置信度E3连接酶，泛素-蛋白酶体系统包含超过1400种蛋白质，约占蛋白质组的7%。经典泛素化中Ub的C端甘氨酸与底物赖氨酸ε-氨基形成异肽键，Ub自身可在其七个赖氨酸残基或N端甲硫氨酸（M¹）上泛素化形成多聚Ub链。K⁴⁸连接链主要介导蛋白酶体降解，K⁶³连接链参与非蛋白水解信号传导。Ub可被磷酸化、乙酰化等PTM进一步调控，这些组合的Ub代码由含Ub结合结构域的阅读蛋白解码。泛素化可被去泛素化酶（DUBs）逆转。非经典泛素化通过酯键靶向丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸，例如内质网相关降解（ERAD）中病毒E3连接酶和宿主Hrd1介导的Ser/Thr泛素化，线性泛素链组装复合物（LUBAC）中HOIP催化M¹连接，HOIL-1泛素化IRA Kinases的Ser/Thr，MYCBP2催化Thr泛素化，以及PEX5在Cys11上通过硫酯键的单泛素化。这些发现表明非赖氨酸泛素化是功能重要的调控层次。近年来发现Ub可缀合至其他PTM靶标如聚糖和ADP-核糖（ADPr），以及非蛋白质生物分子如脂质、糖类、代谢物、核酸和合成小分子，将泛素化重新定义为更广泛的修饰。

Ubiquitination of lipopolysaccharide and phospholipids：首个非蛋白质类泛素化实例是宿主E3连接酶RNF213（Mysterin）对细菌脂多糖（LPS）的泛素化。RNF213通过其RZ锌指结构域和ATP结合结构域，依赖泛素结合酶E2 L3（UBE2L3），将Ub缀合至LPS的脂质A部分，形成对碱水解敏感的氧酯键。此泛素化招募线性泛素链组装复合物（LUBAC），在细菌周围形成K⁶³和M¹连接的多聚Ub外衣，吸引自噬受体触发异源自噬。病原菌进化出对抗机制，如伯克霍尔德菌分泌酯酶TssM直接去泛素化，志贺菌效应子IpaH1.4泛素化并降解RNF213。此外，磷脂酰乙醇胺（PE）的泛素化从酵母到人类保守，主要发生在内吞体和溶酶体膜，由泛素结合酶Ubc4/5和跨膜泛素连接酶Tul1催化，Ub缀合至PE的氨基基团，被去泛素化酶Doa4逆转。营养饥饿等应激条件下泛素化增强，可能促进内体分选复合物（ESCRT）组分的募集。泛素样蛋白NEDD8和ISG15也可修饰脂质。

Ubiquitination of sugars, metabolites, and glycans：糖原的泛素化由LUBAC组分HOIL-1介导。HOIL-1结合HOIP和SHARPIN，优先与低分支度多聚葡萄糖（polyglucosan）结合，在UBE2L3帮助下将Ub缀合至葡萄糖的C6羟基（氧酯键），形成自噬降解信号。HOIL-1的His510残基对氧酯键泛素化至关重要，且该反应不限于葡萄糖。RNF216也可在体外泛素化麦芽糖。非蛋白质泛素剪切（NoPro-clipping）方法鉴定出体内泛素化的代谢物，包括糖原、甘油和精胺。空腹时小鼠肝脏中约1%的Ub附着于糖原，参与生理性糖原代谢和溶酶体降解。在蛋白糖基化方面，SCF^FBS2/FBXO6 E3连接酶识别N-糖链，招募RBR型E3连接酶ARIH1至NEDD化Cullin1，在endo-β-N-乙酰葡糖胺酶（ENGASE）切除N-糖后，将Ub缀合至N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）的C6羟基以及糖基化序列的丝氨酸/苏氨酸残基，形成非典型泛素链。此过程参与NGLY1缺乏症的病理机制，异常泛素化的Nrf1导致蛋白酶体功能障碍。

Ubiquitination of ADP-ribose, and nucleic acids：人DELTEX（DTX）家族E3连接酶（DTX1、DTX2、DTX3、DTX3L、DTX4）与多ADP-核糖聚合酶（PARPs）协同，将Ub转移至ADP-核糖（ADPr）的3^′-羟基或ADP-核糖基化蛋白上，该修饰可被去泛素化酶USP2或SARS-CoV2 PLpro去除。DTX2与PARP7促进雄激素受体和芳烃受体的ADP-核糖基化依赖性泛素化，导致蛋白酶体降解，这一机制称为ADP-核糖基化依赖性降解。泛素化ADPr（ADPr-Ub）可被E3连接酶RNF114及其旁系同源物（RNF125、RNF138、RNF166）识别，延伸K¹¹连接泛素链，参与DNA损伤应答。在tankyrase调控中，DTX2和DTX3对其单泛素化，随后RNF114和RNF166多泛素化，从而抑制RNF146介导的降解。在核酸泛素化方面，DTX3L和DTX2/DTX3直接将Ub缀合至单链DNA/RNA（ssDNA/ssRNA）的3^′-羟基，依赖其RING和DTC结构域。ZNFX1作为RNA相关E3连接酶，与SF1型RNA解旋酶偶联，以ATP依赖方式识别长单链RNA，发生自身泛素化并直接泛素化内部核糖的2^′-羟基，促进致密泛素包被核糖核蛋白颗粒形成，调节RNA稳态和干扰素信号下的应激反应。

Ubiquitination of small-molecule compounds：合成小分子化合物可作为泛素化直接底物。BRD1732被环指蛋白RNF19A和RNF19B在UBE2L3催化下立体特异性泛素化，Ub C端共价连接至氮杂环丁烷氮原子（二级胺），泛素-BRD1732积累导致泛素蛋白酶体系统广泛抑制。HECT型E3连接酶HUWE1将Ub缀合至小分子BI-8622和BI-8626的伯胺基团，这些化合物原为HUWE1抑制剂；体外实验显示HUWE1选择性，且与蛋白质底物竞争。UBE2L3和UBE2D3均参与该反应。这说明含胺基的化合物可作为泛素受体，拓宽了泛素化底物范围。

Concluding remarks：研究共同表明泛素化化学多样性远超经典定义。所有非蛋白质底物（LPS、脂质、糖类、代谢物、ADPr、核酸、小分子）遵循共同化学原理：Ub通过氧酯键（羟基）、硫酯键（巯基）或酰胺键（胺基）连接至亲核基团。这些修饰的可逆性表明主动调控。多数介导非经典泛素化的E3连接酶（如RNF213、HOIL-1、ARIH1、DTX3L、ZNFX1、RNF19、HUWE1）是已知酶，暗示靶向非蛋白质底物的能力比当前认知更普遍。E2酶（如UBE2J2、UBE2Q）可在体外直接连接Ub至羟基。ARIH1无偏性转移Ub至等距离的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和非蛋白质受体，结构距离主要决定修饰形式。随着检测方法改进（如NoPro-clipping），新的泛素化底物将继续出现，需将Ub视为通用化学修饰剂。

Perspectives：泛素化长期被视为蛋白质特异性修饰，但Ub可缀合至脂质、糖类、代谢物、ADP-核糖和核酸以及化学物质，从根本上扩展了其作为通用修饰剂的理解。近期生化与结构研究揭示了非经典泛素化的酶学机制，但大多数非蛋白质底物的生理作用尚待阐明。化学蛋白质组学进展以及检测体内氧酯键泛素化工具的开发，对于完全阐明这一新兴修饰景观的范围和生物学意义至关重要。