《Biosensors and Bioelectronics》：Topology-Encoded Multiplex Diagnostics Enabled by Strand Composition-Controlled Amplification
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Eun Yeong Lee|Dong Geun Lee|Ji-Soo Kwon|Sung-Han Kim|Yong Shin韩国首尔03722，延世大学生命科学与生物技术学院生物技术系摘要要及时区分导致不明原因发热的病原体，多重诊断技术至关重要。然而，由于荧光探针的光谱重叠以及光
Eun Yeong Lee|Dong Geun Lee|Ji-Soo Kwon|Sung-Han Kim|Yong Shin
韩国首尔03722，延世大学生命科学与生物技术学院生物技术系
摘要
要及时区分导致不明原因发热的病原体，多重诊断技术至关重要。然而，由于荧光探针的光谱重叠以及光学通道数量的限制，现有技术的规模化应用面临极大阻碍。在此，我们提出一种基于拓扑编码的诊断策略，将多重检测的维度从光谱空间转变为结构空间，通过不同的电泳迁移率特征而非荧光团组合来实现目标识别。该平台结合了引物阻断不对称扩增技术与可编程DNA纳米结构传感器，目标特异性的单链扩增产物能引发传感器骨架的特定拓扑结构变化，这些变化会产生与不同目标相对应的可区分迁移状态，从而可通过凝胶电泳实现多重检测。我们利用该技术成功检测出了导致临床表现相似的不明原因发热的两种重要病原体——伯纳特柯克斯体和恙虫立克次体，其分析灵敏度高达9.76 aM，且对非目标序列具有高特异性。在121份血浆DNA样本的临床验证中，该平台的阳性符合率为96.4%，所有阴性结果均来自Ct值接近随机极限的低浓度样本；与参考实时PCR相比，其阴性符合率为100%。通过将多重检测编码与光谱限制分离，这项工作为核酸诊断建立了基于结构编码的新框架，不仅提供了可扩展的替代方案，还简化了检测流程，无需多通道检测系统。
引言
不明原因发热及急性发热性疾病在临床诊断中极具挑战性。众多病原体都会引发类似的高热、肌痛、头痛等早期症状，这使得早期经验性治疗十分困难（Aaron和Buchwald，2001）。因此，强大的多重分子诊断技术对于及时区分并准确识别这些不同的病原体至关重要。在复杂的诊断体系中，伯纳特柯克斯体（Q热）和恙虫立克次体是两种常见的难培养病原体，常常让临床医生难以区分（Inoue等人，2011；Saisongkorh等人，2004）。它们在流行地区共同存在，临床表现几乎相同，但需要针对各自特性的治疗方案才能避免严重并发症（Shrestha等人，2018；Vaca等人，2022）。尽管培养法仍是重要的参考手段，但它耗时较长、技术要求高，不适合常规或基层检测。因此，临床诊断已逐渐转向基于核酸的方法（Li等人，2021b；Mothershed和Whitney，2006）。然而，传统qPCR虽然分析灵敏度很高，但通常依赖光谱编码的荧光信号、多通道光学检测以及复杂的仪器设备。这种依赖使得多重检测受限于光谱分离的有限维度，从而制约了其规模化应用（Chen等人，2024）。
DNA纳米技术则为这一难题提供了有力解决方案，它将分子识别转化为结构或拓扑变化，而非荧光信号（Seeman和Sleiman，2017）。尤其是基于线性化的M13mp18支架构建的DNA纳米结构传感器，可以被编程以实现依赖目标的构象转变（Rothemund，2006）。当与相应的核酸触发剂杂交后，传感器会从线性结构变为环状结构，进而产生独特的电泳迁移率特征（Chao等人，2016；Li等人，2021a）。这种基于拓扑编码的检测方式可通过标准电泳实现区分，有效地将信号编码从光谱空间转移到结构空间。与受通道重叠和检测器复杂性限制的光谱编码不同，基于拓扑的编码能够随着结构可编程性的提升而扩展，从而为多重检测提供独立且可扩展的编码维度（Bai等人，2024；Liu等人，2016；Yang等人，2021）。不过，这类基于结构的传感技术在实际应用中，很大程度上受到高纯度单链DNA触发剂供应的限制。
将基于拓扑编码的传感技术付诸实践时的一个核心障碍在于扩增与传感器之间的衔接环节，此时决定下游传感效率的是扩增产物的组成，而非其总体含量。传统PCR主要生成双链DNA，而DNA纳米结构传感器则需要单链DNA触发剂才能引发依赖拓扑的构象转变。虽然传统的不对称PCR试图通过调整引物比例来解决这一问题（Gyllensten和Erlich，1988），但其扩增效率往往较低，需要大量优化，而且仍会生成大量会快速重新退火的双链DNA（McCabe，1990；Sanchez等人，2004；Svobodová等人，2012）。这种重新退火现象限制了可用于结构依赖型目标识别的单链DNA数量，导致了扩增输出与基于拓扑的传感需求之间的矛盾。
为此，我们建立了一种基于拓扑编码的多重检测框架，通过整合可控链组成的扩增技术与基于DNA纳米结构的检测技术，用可编程的分子拓扑结构替代了光谱信号分离。为了实现这种整合，我们开发了引物阻断不对称扩增技术，用于优先富集用于拓扑编码检测的单链DNA触发剂。在这种方法中，链的组成由3′-磷酸化反向引物通过竞争性抑制来调控。由于3′端磷酸化会从根本上阻止聚合酶延伸（Newton等人，1989），该反向引物可以结合到反向引物位点而不被延伸，从而抑制反向链的合成，同时保持正向链的扩增。这种定制化的扩增输出可直接与凝胶电泳双链检测系统相结合，用于同时检测伯纳特柯克斯体和恙虫立克次体。在该系统中，目标识别会转化为单个凝胶泳道内与目标特异性的环状结构相对应的独特电泳迁移率特征。我们使用121份临床血浆DNA样本对该系统的分析性能进行了评估，与参考qPCR相比，对于临床相关的目标浓度（Ct≤36），其阳性符合率为100%，整体符合率为96.4%，阴性符合率也为100%。更广泛而言，这些结果证明了分子拓扑结构可作为多重诊断的独立编码维度，突破了基于荧光光谱编码的局限。
章节节选
M13mp18 DNA支架的线性化处理
为将环状的M13mp18 DNA线性化，我们准备了反应混合物，其中包含5 μL浓度为100 nM的环状单链DNA、0.5 μL与BtsCI限制性位点互补的辅助寡核苷酸，以及10× NEBuffer 2.1，最后用无核酸酶的水将总体积调整至24 μL。该混合物在热循环仪（T100，Bio-Rad，美国）中从95 °C开始以每秒1 °C的速度降温至50 °C，以此在限制性位点处形成局部双链区域
基于拓扑编码的双链诊断平台的设计与原理
基于拓扑的DNA传感技术的一个关键限制在于扩增与传感器之间的衔接环节，此时双链DNA的快速重新退火会干扰传感器的激活过程（Reynaldo等人，2000）。为解决这一问题，我们开发了一种集成型诊断平台，将引物阻断不对称扩增技术与可编程DNA纳米结构传感器相结合（见图1）。如图1a所示，我们的平台采用简化的两阶段工作流程：（1）
结论
我们开发了一种基于拓扑编码的诊断平台，该平台将引物阻断不对称扩增技术与DNA纳米结构传感器相结合，可用于同时检测导致不明原因发热的两种主要病原体——伯纳特柯克斯体和恙虫立克次体。通过精确控制扩增产物的链组成，该方法克服了结构依赖型传感技术的动力学限制，实现了核酸扩增与基于拓扑的信号转导之间的高效耦合。这一
CRediT作者贡献说明
Eun Yeong Lee：写作——初稿撰写、方法学、实验研究、正式分析、概念设计。Yong Shin：写作——审阅与编辑、初稿撰写、监督指导、资源提供、项目管理、资金筹措、概念设计。Sung-Han Kim：写作——审阅与编辑、初稿撰写、监督指导、实验研究、概念设计。Ji-Soo Kwon：资源提供。Dong Geun Lee：方法学、实验研究
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系
致谢
本研究得到了韩国健康技术研发项目的资助，该项目由韩国健康产业发展研究院负责实施，资金来源于韩国卫生福利部（项目编号RS-2025-02223138）。
