《Brain Research》：Network pharmacology-based investigation and in vitro validation of the endothelial protective mechanisms of GZFLW against cerebral ischemia/reperfusion injury
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Fengjuan Ou|Yang Qiu|Shangzhen Yu|Yan Huang中国广东省广州市510120，广州中医药大学第二临床学院神经科摘要目的探讨桂枝茯苓丸对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其潜在机制。方法从TCMSP和BATMAN-TCM中筛选出桂枝茯苓丸的活性成分
Fengjuan Ou|Yang Qiu|Shangzhen Yu|Yan Huang
中国广东省广州市510120，广州中医药大学第二临床学院神经科
摘要
目的
探讨桂枝茯苓丸对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其潜在机制。
方法
从TCMSP和BATMAN-TCM中筛选出桂枝茯苓丸的活性成分及预测靶点，从GeneCards中获取与脑缺血/再灌注损伤相关的靶点。通过蛋白质-蛋白质相互作用网络及GO/KEGG富集分析研究这些靶点的重叠关系。运用分子对接技术分析关键成分与核心靶点之间的结合情况。在大鼠脑微血管内皮细胞中建立氧糖剥夺/再氧化模型，检测细胞存活率、凋亡情况、跨内皮电阻以及FITC-右旋糖酐渗透性。通过Western blotting检测与PI3K/AKT信号通路、凋亡调控及血脑屏障完整性相关的蛋白。
结果
共筛选出43种桂枝茯苓丸的活性成分及108个与脑缺血/再灌注损伤相关的共享靶点。网络分析显示AKT1、BCL-2、TNF、IL6、IL1B、TP53、CASP3和ESR1为关键靶点。槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚和 Hederagenin等主要成分与核心靶点的结合能力较强。在氧糖剥夺/再氧化模型中，含桂枝茯苓丸的血清能提高脑微血管内皮细胞的存活率，抑制细胞凋亡，增强跨内皮电阻，降低FITC-右旋糖酐的渗透性。同时还能激活PI3K/AKT信号通路，上调BCL-2和Claudin-5的表达，下调Bax及p-FOXO1/FOXO1的表达。PI3K抑制剂LY294002可部分逆转这些保护作用。
结论
桂枝茯苓丸可通过调节PI3K/AKT信号通路、BCL-2/Bax凋亡途径及FOXO1/Claudin-5通路，减轻氧糖剥夺/再氧化诱导的脑微血管内皮细胞损伤，改善内皮屏障功能，为其在脑缺血/再灌注损伤治疗中的应用提供了依据。
引言
缺血性卒中是全球神经系统疾病负担的重要原因，会导致高死亡率、残疾及长期功能障碍（Li等，2024；Feigin等，2021）。临床上，静脉溶栓和机械取栓仍是急性缺血性卒中恢复脑血流的重要再灌注策略（Kristoffersen等，2024；Raha等，2023）。然而，虽然再灌注能恢复缺血脑组织的血液供应，但也可能引发继发性损伤，即脑缺血/再灌注损伤。脑缺血/再灌注损伤的病理过程十分复杂，涉及血脑屏障破坏、线粒体功能障碍、兴奋性毒性、炎症反应、氧化应激以及多种程序性细胞死亡形式（Zhang等，2022；Yang等，2025；Guo等，2023）。这些病理因素相互关联，进一步加重神经血管单元损伤，阻碍神经功能恢复。尽管近年来已有大量研究探讨神经保护剂及辅助再灌注疗法，但能够有效阻断脑缺血/再灌注损伤多步骤病理进展的临床药物仍十分有限（Yang等，2025）。因此，探索具有多靶点、多通路调控作用的治疗策略，仍是脑缺血/再灌注损伤防治的重要方向。
桂枝茯苓丸最早记载于《金匮要略》，是一种由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍组成的传统中药方剂。传统上，它被广泛用于活血化瘀，缓解血瘀相关疾病（Liu等，2024）。现代药理学研究表明，桂枝茯苓丸具有多种生物活性，包括改善血液循环、调节炎症反应、减轻氧化应激以及抑制细胞凋亡。其主要活性成分包括槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇，这些成分可能通过多种生物学途径参与血管保护及组织损伤修复（Liu等，2024；Chen等，2024）。近期研究提示，桂枝茯苓丸对脑缺血损伤具有潜在保护作用，说明它可能通过多成分、多靶点的协同调控参与脑缺血损伤的干预（Chen等，2024）。不过，桂枝茯苓丸对抗脑缺血/再灌注损伤的作用机制尚未被充分阐明，其关键分子靶点、调控网络以及对血脑屏障功能的影响也缺乏系统研究。
现有研究表明，在脑缺血损伤及脑缺血/再灌注损伤过程中，PI3K/AKT信号通路参与细胞存活、抗凋亡反应、氧化应激调节以及血脑屏障稳态维持（Liu等，2024；Zheng等，2024）。活化的AKT可调节BCL-2/Bax的比例，抑制细胞凋亡，并通过调控FOXO1相关信号通路参与内皮细胞保护（Liu等，2024）。同时，Claudin-5等紧密连接蛋白表达下降是血脑屏障通透性增强的重要分子基础，保持紧密连接结构的完整性对于减轻脑缺血/再灌注损伤后的脑微血管内皮损伤至关重要（Guo等，2023；Hu等，2024）。然而，脑缺血/再灌注损伤并非由单一通路驱动，而是涉及炎症、凋亡、氧化应激、代谢异常及屏障功能障碍等多层次的网络调控。系统药理学和网络药理学通过整合药物活性成分、疾病相关靶点、蛋白质-蛋白质相互作用及信号通路数据，为揭示传统中药方剂的复杂作用机制提供了有效手段（Zhao等，2023；Li等，2023；Zhai等，2025）。因此，将网络药理学预测与实验验证相结合，可从系统层面明确桂枝茯苓丸在脑缺血/再灌注损伤干预中的潜在分子机制。
基于上述考虑，本研究采用网络药理学、分子对接技术及体外实验，系统探讨了桂枝茯苓丸减轻脑缺血/再灌注损伤的机制。首先筛选出桂枝茯苓丸的活性成分及与脑缺血/再灌注损伤相关的靶点，构建“成分-靶点-通路”网络，进而通过蛋白质-蛋白质相互作用分析及分子对接筛选关键靶点。随后在原代大鼠脑微血管内皮细胞中建立氧糖剥夺/再氧化损伤模型，评估桂枝茯苓丸对细胞存活率、凋亡及血脑屏障功能的影响。鉴于PI3K/AKT信号通路在细胞存活、凋亡调控及血脑屏障完整性中的作用至关重要，本研究进一步分析了AKT1、BCL-2/Bax及FOXO1/Claudin-5通路在桂枝茯苓丸保护作用中的作用。这些研究结果为桂枝茯苓丸在脑缺血/再灌注损伤治疗中的多成分、多靶点特性提供了实验依据。
章节要点
桂枝茯苓丸潜在靶点的收集
桂枝茯苓丸的化学成分及其潜在治疗靶点是从传统中药系统药理学数据库（TCMSP，版本2.3；访问地址：https://lsp.nwu.edu.cn/index.php，访问时间：2025年3月）以及中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM，版本2.0；访问地址：https://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/#/home，访问时间：2025年3月）中获取的。这些数据库中包含的ADME相关参数被用于评估
桂枝茯苓丸抗脑缺血/再灌注损伤的网络药理学分析及关键节点识别
为探究桂枝茯苓丸抗脑缺血/再灌注损伤的机制，本研究采用了网络药理学与实验验证相结合的方法（图1A）。根据OB≥30%且DL≥0.18的筛选标准，从TCMSP和BATMAN-TCM数据库中筛选出活性成分，共得到43种活性成分，其中桂枝含有6种，茯苓含有6种，赤芍含有14种，牡丹皮含有6种，桃仁含有18种（见表1）。这些成分
讨论
桂枝茯苓丸是一种具有多成分、多靶点治疗特性的传统中药方剂，已被广泛用于治疗血瘀相关的心脑血管疾病（Li等，2007；Gao等，2022）。在本研究中，通过网络药理学、分子对接技术及体外实验相结合的方式，探究了桂枝茯苓丸抗脑缺血/再灌注损伤的保护机制。共筛选出43种活性成分及108个与脑缺血/再灌注损伤相关的共享靶点
结论
桂枝茯苓丸可通过多成分、多靶点调控，减轻氧糖剥夺/再氧化诱导的脑微血管内皮细胞损伤，改善内皮屏障功能。其保护作用与PI3K/AKT相关信号通路、BCL-2/Bax介导的凋亡调控以及FOXO1/Claudin-5相关的屏障保护通路有关。这些研究结果为桂枝茯苓丸在脑缺血/再灌注损伤模型中的内皮保护机制提供了实验依据。未来还需要开展体内实验及药代动力学研究来进一步验证其作用
未引用参考文献
Feigin和Stark，2021；Li等，2023a；Li等，2023b；Liu等，2024a；Liu等，2024b。
CRediT作者贡献声明
Fengjuan Ou：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，方法学研究，实验研究，概念设计。Yang Qiu：论文撰写——审阅与编辑，概念设计。Shangzhen Yu：论文撰写——审阅与编辑，实验研究。Yan Huang：论文撰写——审阅与编辑，验证研究。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本论文研究的已知财务利益或个人关系。
