综述：控制距离、时间与反应性：邻近标记的化学原理

《Current Opinion in Chemical Biology》：Controlling distance, time and reactivity: Chemical principles of proximity labeling

　　

邻近标记（PL）通过产生短寿命活性中间体共价标记邻近生物分子，已成为空间蛋白质组学及活体系统中蛋白质-蛋白质相互作用研究的核心策略。然而，PL的性能关键指标——标记半径、时间分辨率和生物相容性——最终由这些中间体在体内的产生、限域与淬灭方式决定。本文以活性中间体生成为组织性化学框架，比较主要PL技术类型，重点关注以蛋白质组为核心的PL系统，同时指出该框架可拓展至其他生物分子检测体系。文中讨论了过氧化物与氧气驱动的平台（可产生酚氧自由基和醌亲电试剂）、ATP偶联连接酶策略（可将活化中间体转移至邻近亲核基团）以及光触发光催化系统（可产生卡宾或氮烯、单线态氧或活性氧自由基、以及光氧化还原脱笼亲电试剂）。通过对不同体系的梳理，本文强调了决定技术操作边界的权衡因素，并提出了下一代PL的设计原则：实现定量、低干扰及更高体内兼容性。

引言

过去15年间，邻近标记（PL）已成为空间蛋白质组学与活体系统蛋白质-蛋白质相互作用研究的强有力工具。其核心机制依赖于局部产生的短寿命活性中间体，在纳米尺度距离内共价修饰蛋白质，从而引入可用于下游成像或富集的化学标签。从操作层面看，有效标记扩散距离（Δx）可由扩散-寿命关系近似描述：Δx ～ √(D_eff· τ_eff)，其中τ_eff为有效寿命，D_eff为有效扩散系数，二者均受局部淬灭作用与微环境影响。尽管PL方法多样，但其发展的核心机理问题具有一致性：活性中间体如何在原位被产生、空间限域与淬灭。本综述以活性中间体生成为核心组织原则，阐释PL的化学本质与应用价值，重点说明不同中间体生成路径如何在各类生物学场景中形成差异化的操作边界与权衡，并展望可拓展PL应用范围的新化学策略。

H₂O₂与O₂驱动的邻近标记

过氧化氢（H₂O₂）作为过氧化物酶共底物，被广泛用于驱动原位产生活性自由基以实现邻近标记，该策略支撑了辣根过氧化物酶（HRP）与工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX/APEX2）等常用工具的应用。HRP在细胞外活性高，但在还原性胞质中不稳定；APEX则可在多种细胞区室中保持功能。在PL过程中，这类酶通过单电子氧化酚类探针（最常用生物素苯酚BP与炔基苯酚AP），生成短寿命（<1 ms）、膜不通透的酚氧自由基，进而以接触依赖与扩散介导的机制，在酶周围约10–20 nm半径内与邻近富电子侧链（如酪氨酸，较少见半胱氨酸）发生反应，实现空间分辨的蛋白质组学研究。近期开发的APOX源自APEX2，针对高氧化还原电位硝基苯酚（NP）探针优化，其自由基生成速度更快、寿命更短，可实现标记半径的精细调控。

经典过氧化物酶PL流程依赖外源脉冲式H₂O₂（通常约1 mM），可能引发氧化应激，限制了其在活体生物系统中的应用。鉴于H₂O₂相关细胞毒性的担忧，部分研究探索过氧化物酶活性是否可由生理水平H₂O₂支持。有研究表明，HRP可利用内源性H₂O₂标记细胞间接触区域，而APEX2表现较差，可能因其催化效率较低且缺乏糖基化修饰，影响其在胞外或分泌环境中的折叠稳定性。此类低H₂O₂流程能否获得足够用于蛋白质组学的标记产量仍不明确。为规避外源H₂O₂添加，研究者尝试原位局部生成H₂O₂：将半乳糖氧化酶（GAO）与HRP共靶向HeLa细胞表面，可使GAO产生的H₂O₂驱动HRP对混合细胞群中具有不同唾液酸（Sia）依赖糖基化模式的细胞进行标记；iAPEX系统则将D-氨基酸氧化酶（DAAO）与APEX2共表达于初级纤毛，外源添加D-氨基酸可直接在纤毛处生成H₂O₂，激活预装载生物素苯酚的APEX2。这类共定位氧化酶-过氧化物酶系统克服了局部H₂O₂供应限制，但仍需共表达、外源底物添加，并对抗氧化淬灭敏感。此外，氧化还原活性材料也被用于提升过氧化物酶PL性能，例如HRP适配体系统偶联铁基NH₂-MIL-88B金属有机框架（MOF），其Fe²⁺/Fe³⁺中心作为电子穿梭体，可加速HRP催化，使低丰度靶标的标记量提升2–3倍。尽管前景良好，但此类材料仍存在生物相容性、芬顿化学所致毒性、自由基化学可控性及胞内应用等方面的顾虑。

除H₂O₂的细胞毒性问题外，近期研究探索了更低毒性的PL替代方案。2024年，Hamachi团队报道了一种源自巨大芽孢杆菌的酪氨酸酶，利用胞内O₂（而非H₂O₂）激活酚类底物，生成邻醌中间体用于PL。该系统动力学快（约10分钟），在细胞内细胞器中背景生物素化极低，已应用于小鼠脑突触蛋白质组图谱绘制。随后Qin团队的研究表明，酪氨酸酶PL（称为TyroID）在细胞表面表现最优，因其需要铜离子补充，而铜离子可能引发胞内毒性与脱靶氧化。近期Ting团队开发了LaccID——一种工程化漆酶，利用生物素甲氧基苯酚（BMP）进行O₂依赖的标记，其自由基较生物素苯酚更稳定，但可能降低空间限域性。值得注意的是，LaccID活性局限于细胞表面，可能因其依赖二硫键形成与糖基化以实现正确折叠，且其最适pH为酸性（4–5），卤化物抑制会阻断O₂进入铜活性位点；此外，其较长标记时间（约2小时）可能限制蛋白质组学的时间分辨率。

ATP驱动的标记

在许多生物合成反应中，酶将ATP水解与活化中间体（如酰基腺苷酸、酰基磷酸或硫酯）的生成相偶联，这些中间体通常被限制在活性位点内并转移至特定亲核受体。在PL中，酶工程可增加这些中间体在活性位点外的有效可及性，使其能够与邻近蛋白质反应，因此ATP驱动PL平台在ATP充足（3–5 mM范围）的胞内环境中效果最佳。

最常用的ATP驱动PL酶是生物素连接酶。天然状态下，以大肠杆菌连接酶BirA为代表，这类酶催化ATP依赖的生物素活化，形成生物素-5′-AMP中间体，并将其转移至最小化为15个残基的AviTag识别序列内的赖氨酸。该位点特异性已被用于筛选E3泛素连接酶的推定内源性底物：将携带AviTag的泛素与融合E3连接酶的BirA共表达，可驱动E3连接酶附近泛素化底物的生物素化。

大肠杆菌BirA的单点突变（R118G）可实现混杂标记，生物素-5′-AMP转移至邻近蛋白质的赖氨酸侧链或N端氨基等可及亲核基团。动力学测定显示，R118G突变增加了BirA-生物素与BirA-生物素-5′-AMP复合物的解离常数，表明腺苷酸中间体的滞留能力下降。但较弱的滞留并不意味着长程扩散：近期一项利用体外DNA纳米结构平台的研究显示，最大标记信号出现在约6 nm处，<6 nm时产量下降，超过6–7 nm后急剧降至接近背景水平；此外，生成的生物素-5′-AMP可在酶口袋中滞留长达10秒。这些结果挑战了长期存在的扩散模型——即生物素-5′-AMP从连接酶解离并标记远端氨基；该模型本应预测中间体短寿命且标记产量随距离单调下降。

基于这一化学基础，过去十年对生物素连接酶的工程改造产生了可在不同实际场景中操作的PL酶。其中TurboID应用最广，可在数分钟内跨不同亚细胞区室与多种物种中实现稳定可重复的标记，并日益应用于小鼠模型，解析均质化组织样本中可能被掩盖的疾病相关蛋白质组重塑。例如，Plucińska等开发了Cre依赖的内质网靶向TurboID-KDEL小鼠模型，用于细胞类型特异的分泌途径与循环蛋白质组分析，揭示了禁食、炎症与饮食诱导肥胖条件下的能量平衡依赖重塑。

PhastID是近期开发的源自嗜热火球菌的生物素连接酶类ATP驱动PL工具，支持快速标记，因细胞毒性更低、背景更少，在短标记窗口与动态互作图谱绘制方面较TurboID更具优势，已被用于捕获胰岛素应答的Rheb邻近蛋白，并鉴定出ATP6AP1作为mTORC1激活的调节因子。

除生物素连接酶外，ATP偶联PL还可通过邻近依赖的小蛋白修饰因子转移实现。NEDDylator重新利用天然ATP依赖的NEDD8缀合级联，利用诱饵融合的Ubc12通过Ubc12-NEDD8硫酯中间体将NEDD8转移至邻近赖氨酸ε-氨基。类似地，PUP-IT改造细菌Pup连接酶PafA用于ATP偶联PL：PafA利用ATP磷酸化Pup(E)的C端谷氨酸，再将Pup转移至诱饵附近蛋白质的赖氨酸ε-氨基。拟南芥中的近期研究展示了PUP-IT在植物中的应用价值，可鉴定纤维素合成调节因子ARF-GEF BEN1，并定义拟南芥TOR信号复合物的蛋白质与磷酸化蛋白质组装。

近期，Ting实验室应用构象偏倚（CB）设计策略改造脂肪酰连接酶LplA——一种ATP依赖的腺苷酸化形成酶，其天然功能是连接硫辛酸至同源底物蛋白。通过使LplA偏向更“开放”的构象，研究人员获得了具有增强混杂活性的变体，可用于PL。

光催化邻近标记（PPL）

与酶促活性中间体生成互补的策略是利用光作为激活触发因素。不同于依赖细胞辅因子的酶促PL，PPL允许通过外部精确控制活性中间体的生成时空。通过调整波长、照射时间与光剂量，近期平台可提供快速时间控制与细胞内空间受限激活。光照区域决定了活性中间体的生成位置，而标记半径则由中间体寿命、扩散与局部淬灭共同决定。光递送（尤其在组织中）仍是挑战。

在光触发PL中，光催化剂、激发条件与反应路径决定了生成的活性中间体类型；标记则取决于催化剂定位、探针定位以及活性中间体淬灭或衰减前的寿命。因此，有效标记距离（Δx）由中间体寿命、扩散、探针浓度、氧气可得性、局部清除剂与光照暴露共同塑造。

能量转移路径：三重态敏化与有机辅因子

高分辨率PPL平台如μMap通过Dexter型三重态能量转移激活重氮化合物，生成活性卡宾中间体。由于三重态能量转移需要紧密轨道重叠，活性物种仅在催化剂附近生成，而卡宾短寿命与快速水相淬灭将标记限制在狭窄空间范围内。实际操作中，有效半径受催化剂定位、连接子几何结构与局部淬灭影响；相关μMap衍生平台已实现瞬态细胞表面微环境的时间空间分辨图谱绘制。μMap-Interface系统进一步展示了Fc受体驱动吞噬过程中的探针依赖性可调性；近期多尺度光催化PL研究表明，更换光探针可调控细胞表面及细胞间的有效空间覆盖范围——单个曙红Y光催化剂可激活重氮化合物、芳基叠氮与酚类探针，在同一工作流程中实现高、中、低分辨率的互作组分析。

过渡金属光催化剂存在细胞毒性、溶解度与胞内兼容性方面的顾虑，推动了用于能量转移PPL的有机辅因子开发。DarT标记通过脱氮黄素光催化剂在活细胞中通过三重态能量转移激活重氮化合物，解决了上述问题，将卡宾类高分辨率标记拓展至生物相容性更高的胞内场景。该平台对光催化剂与探针定位的改进有助于降低背景，支持时间分辨互作组测量。

氧介导的光化学：¹O₂作为化学介质

许多PPL平台采用氧介导光化学，光敏剂三重态通过短程能量转移生成单线态氧（¹O₂）。在此类系统中，¹O₂在激发态光敏剂附近生成，其有效覆盖范围受局部氧气可得性与邻近生物分子淬灭的限制。尽管¹O₂的理论扩散长度可根据微秒级动力学估算，但细胞内的有效范围更短，受拥挤效应、区室化与内源性淬灭剂影响。CAT-Tissue将此逻辑拓展至原代组织，结合纳米抗体靶向的二氢卟吩e6（Ce6）光催化剂与生物素苯胺，在660 nm照射下实现超快标记，NaN₃淬灭实验支持¹O₂主导的机制。近红外平台进一步拓展了氧介导PPL的生物适用范围：SeeID以硅罗丹明（SiR）同时作为荧光标签与光催化剂，实现成像引导的邻近标记，具有高胞内特异性，并在660 nm照射下实现小鼠皮层内约2 mm深度的体内标记。近期体内兼容拓展如PATCH进一步体现了光催化PL的多功能性：该系统中含锆与卟啉的多孔配位网络纳米酶，可在深红光或超声下支持细胞表面标记——红光激活驱动生物素-苯酚类标记，超声激活驱动生物素-胺类标记，从而实现组织选择性体内标记与抗原扩增。

氧基PPL不限于II型¹O₂化学。LipoID使用脂滴靶向小分子光催化剂，优先生成I型活性氧（ROS），包括超氧与羟基自由基，而非¹O₂。这些短寿命自由基无需遗传标签即可原位捕获脂滴互作蛋白，并产生与¹O₂系统不同的反应区域，因其由自由基混合物自身的寿命与反应性决定。

光氧化还原（SET）PPL：红光激活与脱笼

红光与近红外光PPL通过激发态单电子转移（SET）进行，而非直接三重态能量转移。此类系统的关键是氧化还原匹配：激发态光催化剂必须具备足够的还原或氧化能力以激活探针并启动活性中间体形成。

红光PPL适用于短波长存在散射、穿透浅或光毒性的场景。例如μMap-Red在660 nm光下使用锡二氢卟吩e6光催化剂，通过SET化学激活芳基叠氮。相关光氧化还原系统（包括深红实施方案）同样表明，芳基叠氮可产生具有独特反应谱的三重态氮烯类中间体。所有这些案例中，长波长激活拓宽了生物兼容性，但标记仅发生在催化剂定位、探针可及与光照暴露重合的区域。

光催化脱笼平台如CAT-Prox将光触发探针激活与标记事件分离。该策略中，局域化光催化剂触发SET介导的光笼前体脱笼，启动自毁反应释放喹啉甲烷（QM）亲电试剂，进而捕获邻近亲核基团。由于这类醌衍生中间体的存续时间显著长于卡宾，其有效标记扩散不仅由催化剂位置决定，还受释放亲电试剂的寿命与扩散影响。硫代QM（thioQM）变体通过加速脱笼后的弹头形成并提高亲核捕获效率，提升了原代活体样本（包括解离组织与人血液T细胞）中的标记效率与特异性。总体而言，这种脱笼-捕获设计可适配细胞器特异性PL，并已拓展至内质网与溶酶体等更多胞内环境。

结论与未来展望

邻近标记为在天然生理环境中追踪生物学事件与研究蛋白质功能提供了强有力的手段。PL的性能与适用性最终由活性中间体的生成方式、扩散距离及其向邻近靶标转移的化学路径决定。展望未来，PL的发展将依赖于对活性中间体生成与限域的更精准控制、标记扩散的定量校准、对复杂组织与亚细胞微环境的更广泛兼容性，以及与正交成像和富集读取技术的整合。

该领域的优先方向是将PL从活细胞技术发展为真正具备体内测量能力的技术。这一演变需要摆脱对外源氧化剂（特别是H₂O₂）的依赖，且不牺牲时间精度。研究人员应设计模拟天然代谢物的探针，以获得可预测的体内分布与局域寿命，而非迫使细胞耐受合成极端条件。此外，单一平台应支持正交输出：用于定位的荧光成像、用于富集与质谱分析的亲和手柄，以及可提高工作流程灵活性的可切割连接子。严格定量是PL的下一个前沿方向：有效半径Δx必须从假定常数转变为可报告参数，并以细胞器边界或确定的残基间距离为基准进行校准。通过将Δx视为可调、环境依赖的结果，PL将从定性筛选进化为可预测的定量测量技术，使研究人员能够根据具体生物学问题选择适合高分辨率精细图谱绘制或广谱灵敏发现的技术路线。最后，探索邻近标记与多组学方法的兼容性，有望为整合性生物学认知开辟新途径。