综述：单分子福斯特共振能量转移与氢-氘交换质谱技术的结合在动态结构生物学中的应用

《Current Opinion in Structural Biology》：Combination of single-molecule F?rster resonance energy transfer and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry toward dynamic structural biology

　　

魏晨|伊丽莎白·A·科米维斯

美国宾夕法尼亚州立大学化学系，宾夕法尼亚州大学公园市

要理解蛋白质的功能，就需要描述其结构动态。要探究不同时间和长度尺度上的这些结构动态，就需要采用不同的方法，往往还需要将多种方法结合起来使用。在此，我们介绍了两种高度协同且互补的方法——单分子弗斯特共振能量转移技术（smFRET）和氢-氘交换质谱技术（HDX-MS）。我们阐述了这两种方法在揭示结构与动态异质性、覆盖的蛋白质残基范围以及所能检测的蛋白质运动类型方面的互补作用。通过结合使用这两种方法，可以研究从整体刚性运动到局部展开等多种蛋白质动态。这种协同作用有助于阐明信号传导和转录过程中的激活与调控机制，我们在五个案例研究中对此进行了介绍，强调了这两种方法在推动动态结构生物学发展中的关键作用。

章节节选

结构动态：为静态结构生物学增添时间维度

生物功能通常与结构随时间的变化密切相关。这些结构重排参与了诸多过程，包括配体结合、大分子识别、别构效应、分子机器或复合体的形成、分子运输、酶催化等[1, 2, 3]。参与这些过程的蛋白质往往具有较高的结构灵活性。虽然这些蛋白质的某些部分会稳定为一种或几种特定结构

smFRET与HDX-MS的协同性与互补性

smFRET最强大的优势在于它能够揭示其他方法无法捕捉到的异质性。通过逐个记录数百到数千个单个分子的荧光信号，可以了解2–8纳米范围内的分子间或分子内距离分布。这往往能发现那些在快速成像或整体分析方法中会被忽略或平均掉的未知亚状态或中间态。

smFRET的时间分辨率取决于其检测方式，而

I?Bα锚定重复序列中的局部展开及弹簧状运动

最早将HDX-MS与smFRET结合用于动态研究的案例之一，就是研究I?Bα中的局部展开及弹簧状运动（图2a）。I?Bα是快速诱导型NF-?B转录激活的主要抑制剂。I?Bα包含六个锚定重复序列（AR1至AR6），其中AR1至AR4会协同折叠，所有这些重复序列都会与NF-?B结合[37]。HDX-MS研究表明，最后的两个重复序列AR5和AR6在溶液中仅处于弱折叠状态，而在与NF-?B结合后才会发生折叠[38,39]

NF-?B中的别构通信、短暂界面及结构域间运动

HDX-MS与smFRET的结合还帮助阐明了NF-?B的重要动态特性及其调控作用（图2b）。NF-?B是一种转录因子，参与多种细胞反应，尤其是与免疫系统相关的反应。NFκB是一种二聚体，其稳定性依赖于二聚化结构域之间的相互作用。这些二聚化结构域通过灵活的连接链与DNA结合结构域相连，而这些连接链也会与DNA接触。HDX-MS研究表明，I?Bα会与NF-?B结合

G蛋白偶联受体的别构效应与激活途径

smFRET与HDX-MS的结合也被用于研究G蛋白偶联受体（GPCR）的激活动态。通过对负责血糖稳态的B族GPCR——胰高血糖素受体（GCGR）及其活性调节蛋白RAMP2的研究，HDX-MS表明，当RAMP2与跨膜结构域结合时，该受体的配体结合结构域（也称为捕蝇草结构域）会变得更加无序[48]。这种无序程度的增加也可以通过

Hsp90的别构途径、多尺度动态及辅助伴侣蛋白的调控作用

HDX-MS与smFRET还为分子伴侣Hsp90的多尺度构象动态及别构途径提供了重要见解（图2d）。Hsp90是一种依赖ATP的二聚体伴侣蛋白，在其功能周期中会经历较大的构象变化，而这些变化受到核苷酸结合及辅助伴侣蛋白的严格调控。早期的HDX-MS研究表明，N端ATP结合位点的配体结合会引发Hsp90三个结构域的整体结构变化。

表皮生长因子受体中的膜依赖性构象调控及短暂细胞内相互作用

表皮生长因子受体（EGFR）是一种膜受体酪氨酸激酶。它的激活依赖于细胞外、跨膜及细胞内各部分的协同重排。HDX-MS研究已经明确了EGFR中的有序区域和无序区域，并找到了关键的相互作用界面[57, 58, 59]。对可溶性细胞外结构域（exEGFR）的分析表明，大部分β折叠结构相对不易发生交换，但某些特定区域则会出现

总结

smFRET与HDX-MS在揭示结构异质性、覆盖蛋白质残基范围以及解析不同时间和长度尺度上的动态特性方面具有协同性和互补性，因此将二者结合使用能够揭示对蛋白质功能至关重要的运动模式。NF-?B、I?Bα、GPCRs、Hsp90和EGFR的案例研究都证明了这一点，通过结合使用这两种方法，我们得以阐明信号传导和转录过程中的调控机制。尽管许多相关研究最初主要依靠TIRF技术

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。