《Current Opinion in Structural Biology》：Toward 3-D genome visualization with in situ cryo-electron tomography
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本综述聚焦于冷冻电子断层成像（cryo?electron tomography, cryo?ET）如何推动真核生物染色质在原位（in situ）层面的结构细胞生物学研究，并探讨连接结构细胞生物学与三维基因组学领域所需的技术支撑。cryo?ET是一种冷冻电镜技术
本综述聚焦于冷冻电子断层成像（cryo?electron tomography, cryo?ET）如何推动真核生物染色质在原位（in situ）层面的结构细胞生物学研究，并探讨连接结构细胞生物学与三维基因组学领域所需的技术支撑。cryo?ET是一种冷冻电镜技术，通过对冷冻含水样品从多个角度成像，将二维投影图像经计算重构为称为冷冻断层图（cryotomogram）的三维图像。该技术适用于纯化/重组核小体阵列、分离染色体、分离细胞核、完整细胞及组织样品，尤其在对细胞和组织进行成像时，可实现生理状态下染色质结构的原位解析。该领域目前仍处于起步阶段，尚不具备基因组学所拥有的通量与可扩展性；待关键标记与图像分析技术成熟后，“结构基因组学”有望同时提供纳米级三维空间分辨率与碱基对序列空间分辨率，从而阐明细胞内基因调控的基本机制。
引言
早在数十年前，已有两项先驱性冷冻电镜研究针对真核生物染色质的原位结构展开。这些研究采用冷冻含水细胞切片，并利用低温金刚石刀减薄样品，其中“冷冻含水”指细胞被极速冷冻，水分子来不及重排为结晶态，且样品全程维持在低于?150?°C的低温环境以防止破坏天然结构的脱玻化现象。对上述冷冻核切片的二维投影图像进行傅里叶分析，明确排除了30?nm纤维模型作为原位核小体组装主导形式的假说。当前，低温聚焦离子束（cryogenic focused?ion?beam, cryo?FIB）减薄技术在样品制备中的使用已超越传统冷冻切片，而cryo?ET也逐渐取代二维投影成像成为原位染色质结构分析的主流方法。cryo?FIB减薄兼具半自动化优势与最小的减薄伪影，cryo?ET则将染色质置于三维空间背景下进行研究。2016年，cryo?FIB与cryo?ET技术的进步使得研究人员能够在培养的人类细胞中解析细胞核结构。三维子断层图分类与平均软件的进展，实现了人类细胞原位典型核小体的检测——所谓典型核小体，是指具备晶体结构特征的结构：尺寸约10?nm?×?6?nm的圆柱体形态，带有约1.6圈左手螺旋的DNA圈密度。近期多项原位染色质研究进一步证实，在厚度小于约200?nm的样品中，典型核小体可在多种人类与非人类细胞类型中被检测到。
原位cryo?ET的优势在于能够在天然环境中揭示染色质结构，即同时考虑翻译后修饰、核质复合物、细胞内机械力、大分子拥挤效应、核膜相互作用及相分离效应等因素的综合影响。值得注意的是，这些细胞内现象并非彼此独立，因此难以单独分离某一生化或生物物理参数的作用。相比之下，体外（in vitro）cryo?ET与单颗粒冷冻电镜染色质研究虽具有更高分辨率与明确的蛋白、核酸组分，但缺乏原位环境的复杂性。体外分析常能获得优于～3??的分辨率，从而支持基于结构导向诱变的可检验假说，并以机制性语言进行直观解释。原位cryo?ET的长期目标，是在生理背景下澄清、启发并验证几乎全部基因调控过程的结构与机制解释。
近期关于原位寡核小体结构的新见解
借助可重复的模板匹配、子断层图分类与平均方法，研究人员已在哺乳动物细胞类型中成功开展核小体水平的染色质cryo?ET研究，重点关注间期核周异染色质和有丝分裂期染色质。间期细胞核周边的染色质富含典型核小体，且其连接DNA的有序长度存在变异。与之不同，有丝分裂期RPE?1细胞中的所有典型核小体类别均仅含有短片段的有序连接DNA，意味着有丝分裂期典型核小体采取类似染色小体（chromatosome）的结构。核小体的高阶组装方式因细胞系而异：核周区域主要观察到两种常见高阶结构，其一是T细胞中20–50?nm厚的纤维状结构，其二是RPE?1细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和NIH3T3小鼠成纤维细胞中的大型不规则结构域。在约10?nm尺度上，NIH3T3细胞的核小体呈随机堆积，而RPE?1细胞与分离T细胞中的部分核小体可形成有序的二核小体堆叠，表现为包含两个堆叠典型核小体的分类平均结构；值得注意的是，所有已研究的哺乳动物细胞系中均可观察到有序程度较低的堆叠现象，即在将单核小体分类平均重新映射回其来源断层图时可被检测到。这种细微的细胞系依赖性核小体堆积差异，提示纳米尺度的染色质结构差异可能在基因表达程序中发挥作用。
现有研究已证明原位cryo?ET能够以不断提高的分辨率稳定解析核小体，并对更多连续核小体进行建模。然而，这些研究尚未揭示支配细胞内染色质结构的明确结构生物学原理，反而强化了有序模型（如30?nm纤维）仅在理想体外条件下稳定的观点。目前反复出现的结构基序是不规则的锯齿形排列，但其“不规则”程度仍有待量化。一项针对G1期与中期细胞的比较研究显示，连接DNA结构变异性与堆叠方式存在细微差异，提示转录更活跃的G1期染色质有序性更低；由于多数研究未明确细胞周期状态，该结论是否具有普适性仍不清楚。未来仍需更多工作将观察到的核小体间排列与相互作用同功能状态关联起来。为此，研究人员提出将原位cryo?ET研究与基因组学相结合，相关讨论将在后续章节展开。
原位cryo?ET见解与现有模型的冲突
原位cryo?ET的独特贡献在于揭示体外研究中罕见的结构现象，从而帮助解析核小体结构如何在原位精细调控基因表达。在芽殖酵母与裂殖酵母中，核小体分类平均的定量分析显示，仅不到10%的核小体群体符合典型核小体的特征。尽管体外核小体（单独或与其它蛋白复合）研究提供了非典型核小体三维组织的线索，例如DNA进出位点附近易发生解旋，形成部分解绕的核小体，但这些体外非典型结构尚未在原位酵母核小体分类平均中被观察到，提示酵母中的非典型核小体状态要么比体外对应物更扭曲，要么过于异质化以至于现有数据与工作流程无法解析。酵母中典型核小体丰度低可能源于多种技术因素，但所有已知因素均已被控制或不影响典型核小体的可检测性；近期在RPE?1细胞中的研究进一步表明，即便使用大幅降低图像对比度的9%?DMSO或9%甘油处理，典型核小体依然可被检测到，说明图像对比度并非限制因素。关于原位非典型核小体结构的线索来自HeLa细胞核周的cryo?ET研究，该研究报道了具有4次对称性的核小体；另一项果蝇胚胎组织的研究则报道了罕见的类似部分解绕或三重缠绕核小体的密度，但后生动物中非典型核小体的丰度仍未知。相较于典型核小体，结构发生改变的核小体在机制上具有重要意义，因为它们暴露了更多DNA与蛋白质表面给基因调控机器。详细解析原位非典型核小体结构，不仅能启发新的基因调控假说，还能为高分辨率基因组学提供更好的约束条件——后者通常假设核小体具有典型结构。
基因调控中的一个重要概念是“开放”与“关闭”染色质，分别对应于核小体密度较低与较高的区域。虽然原位cryo?ET可直接观察核小体，但它无法直接反映被称为“可及性”的时间依赖属性。染色质可及性检测（如ATAC?seq及近期开发的基于腺嘌呤甲基转移酶的长读长测序）可揭示特定DNA序列在细胞内对酶促作用的敏感频率。近期一项体内DNA甲基化研究表明，酵母染色质整体处于可及状态，这与cryo?ET显示的酵母染色质松散堆积（无哺乳动物细胞中的致密结构域）及非典型结构占主导的结果一致，支持酵母基因组主要为常染色质样状态的假说。有趣的是，MCF7细胞的DNA甲基化研究指出，人类染色质同样整体可及，仅异染色质区动力学较慢；另一项小鼠细胞甲基转移酶研究发现，核小体内的DNA序列也可能具有可及性，支持部分小鼠细胞系中大多数核小体具有非典型特征的结论。Micro?C作为一种高分辨率Hi?C技术，可报告酵母和人类细胞中寡核小体水平的接触概率，结果显示给定核小体与其顺式相邻核小体（n+1、n+2…n+k）的接触频率与cryo?ET观察到的整体锯齿形路径一致，且人类染色质可能更为致密。综上，cryo?ET所见的染色质结构与Micro?C结果总体相符，但与基因组可及性并无简单对应关系，提示应将“开放/关闭”二元分类与核小体动态等非结构属性的作用一并重新审视。
连接结构细胞生物学与基因组学所需的技术
原位cryo?ET所提供的分辨率与细胞内环境背景，使其与基因组学高度互补，有望从核小体结构与寡核小体折叠层面解释可及性与接触概率等概念。然而，目前的原位cryo?ET尚无法通过子断层图平均过程恢复核小体组蛋白特性与DNA序列信息，缺乏将序列信息分配给特定核小体的能力，导致结构生物学与基因组学只能平行发展而非真正融合。研究人员推测，以下四类技术有望连接这两个领域：①在原位冷冻断层图中定位具有独特蛋白/DNA属性的核小体；②提高分辨率；③注释相连的核小体；④提高冷冻断层图注释的准确性。
要将蛋白与DNA信息赋予原位cryo?ET密度，需要一类标记分子：既能活细胞状态下特异性标记目标核小体，又无需额外化学处理即可在冷冻含水细胞样品中被检测到。此类标记可直接结合目标组蛋白（用于标记组蛋白变体），也可结合到特异性识别目标特征的中间蛋白上（用于标记组蛋白翻译后修饰或DNA序列）。荧光分子常用于冷冻相关光镜与电镜联用（cryo?correlative light and electron microscopy）技术，将同一样品的荧光信号与cryo?ET密度对齐；荧光定位精度在X–Y平面约为～200?nm（常规显微镜）至数十nm（单分子定位），Z轴受cryo?FIB减薄方向限制约为～200?nm。但在实践中，荧光标记蛋白复合物的鉴定较为困难，例如近期一项提取染色体中荧光凝缩蛋白的研究就未能将cryo?ET密度明确归属于凝缩蛋白。无机纳米颗粒是另一种标记选择，可通过局部结晶或靶向结合到目标核小体，例如“可克隆”硒纳米颗粒、铁蛋白标签、抗体偶联金颗粒及Halo/纳米金标签等。已有研究通过将标记蛋白融合到组蛋白变体实现组蛋白变体特异性标记，未来或可借助类抗体标记分子实现组蛋白修饰的特异性标记。至于DNA序列的原位cryo?ET定位，据目前所知尚未见尝试；参考活细胞成像研究，或可借助催化失活Cas9（dCas9）或Lac操纵子/Lac阻遏蛋白系统，配合荧光蛋白或纳米颗粒标记来实现。
分辨率是目前原位cryo?ET染色质研究的主要局限之一。现有研究通常可获得约20??的分辨率，足以依据约1.6圈DNA圈、左手DNA弯曲及有序连接DNA突起等特征在分类平均中识别典型核小体。分辨率高于约12??时，可分辨DNA特异性特征（如主沟）；达到约8??时，DNA的主沟与次沟及富含α螺旋的组蛋白折叠均可被解析，这一亚纳米分辨率将允许通过结构特征（如包裹在具有组蛋白折叠蛋白核心上的约1–1.7圈DNA）识别非典型核小体。若达到约3??（侧链/核苷酸分辨率），原位cryo?ET平均结构将有力支持诱变与药物互作研究——原位核糖体研究已实现这一里程碑分辨率，其前提是高信噪比以计算区分构象与组成均一的核小体群，且此类结构均一的核小体数量需达数万个，这意味着要么目标核小体类别天然丰度极高，要么自动化靶向样品制备、减薄、成像与分析的通量需提升数个数量级。
当前核小体的识别通常依赖模板匹配与三维分类，过程耗时且易受模型偏差影响。新型机器学习工具或可提高速度与准确性，其训练数据可来源于模拟原位染色质结构域的大型重组染色质组装体，这类样品的所有密度均来自核小体或亚核小体，同时具备真实噪声、辐射损伤与真实致密性等难以模拟的图像特征，是极佳的真实基准数据源。
目前短核小体链的注释主要基于重新映射核小体子断层图平均的相对取向：若连接DNA密度共轴（但不接触）且核小体间距合理，则判定为相连；少数情况下可见部分重叠的连接DNA密度。若能不依赖子断层图平均直接在原位观察到“裸露”DNA，则连通性分析将更准确。这一目标的实现已在纯化染色质的cryo?ET研究中得到验证，其中可注释出包含数十个连续核小体的链。近期一项研究借助去噪冷冻断层图实现了原位连接DNA的注释，但由于原位信噪比更低且大分子异质性更高，仍需进一步验证这些原位注释，若子断层图平均能同时显示DNA的主沟与次沟特征，则可确认为DNA密度。这一技术挑战在于，要在足够高的分辨率下对连接DNA片段（独立于核小体核心）进行子断层图分析，需要目前尚未实现的对比度水平。若能在原位对大多数核小体的连接DNA进行高置信度建模，cryo?ET将能够量化无序程度、测量寡核小体持续长度、识别短程环并发现短折叠基序。
此外，多尺度模拟、整合建模、高通量样品制备及成像软硬件的改进等跨领域进展同样不可或缺。值得注意的是，整合结构模型需要解决原位cryo?ET（单分子、单细胞、细胞极小区域的快照数据）与基因组学（多为基于群体的全基因组数据）之间的实验不匹配问题。随着原位cryo?ET突破的不断加速，真正的基因组三维可视化时代必将到来。
