基于质谱的筛选揭示胆固醇25-羟化酶抑制剂

《ACS Chemical Biology》：Mass Spectrometry-Based Screening Reveals Inhibitors of Cholesterol 25-Hydroxylase

　　

胆固醇25-羟化酶（CH25H）将胆固醇代谢为25-羟基胆固醇（25HC），并在骨关节炎、阿尔茨海默病和其他疾病中发挥病理作用。作为内质网（ER）驻留的跨膜二铁脂质氧化酶（diiron lipid oxidase），CH25H仍然是一种难以研究的酶，并且目前尚无CH25H的小分子抑制剂。作为开发CH25H抑制剂的第一步，研究人员建立了一种基于质谱的细胞测定法，用于监测CH25H介导的25HC产生。通过对一个包含超过100种小分子（含有铁配位基团或甾烷环系统）的聚焦文库进行该测定法的筛选，发现了三种有效的细胞CH25H活性抑制剂（U73343、Ciclopirox和phenanthroline）。研究人员还开发了一种监测转录反应的CH25H功能二次测定法，该反应被证实是由25HC产生引起的。最后，U73343（而非铁结合化合物）显示出与相关的二铁脂质氧化酶的强选择性。总体而言，这项工作建立了一系列监测CH25H功能的基于细胞的测定法，并提出了针对这种疾病相关酶的首类细胞活性抑制剂。

胆固醇25-羟化酶（CH25H）属于二铁脂质氧化酶（diiron lipid oxidase）家族，该家族由12种人类酶组成，利用非血红素二铁催化核心对甾醇、脂肪酸和鞘脂进行羟基化或去饱和。CH25H将胆固醇转化为25-羟基胆固醇（25HC），这是一种氧甾醇，具有通过LXR进行转录信号传导和膜流化特性等多效性作用。CH25H是一种干扰素刺激基因，在炎症环境之外表达通常较低。CH25H敲除小鼠表型大致正常，但抗病毒能力受损，支持25HC作为抗病毒氧甾醇。然而，进一步研究表明，CH25H活性还通过促进TLR4信号传导和增强NFκB激活而具有促炎特性。这些促炎功能导致多种疾病的病理过程，因为在tau蛋白病、神经炎症、肠纤维化、血管损伤和骨关节炎模型中，CH25H敲除小鼠受到强烈保护。因此，CH25H在免疫中发挥重要作用，也可能成为多种人类疾病中具有前景的治疗靶点。

小分子探针是评估CH25H抑制在疾病模型中治疗效果和潜在靶点相关副作用所必需的。作为开发CH25H抑制剂的第一步，研究人员建立了一种基于气相色谱-质谱（GCMS）的测定法，以直接定量测量CH25H产物25HC的产生。尽管该测定法通量适中，但研究人员将其应用于两个聚焦文库，这些文库包含可能通过配位催化铁中心或模拟胆固醇底物来抑制CH25H功能的分子。通过筛选超过100种分子，研究人员验证了三种细胞CH25H功能抑制剂，每种EC₅₀约为1–2 μM。此外，研究人员还建立了监测转录反应的二次测定法，该反应被验证依赖于CH25H催化活性，同时监测对两种密切相关甾醇代谢二铁脂质氧化酶的选择性。这些研究共同提供了首批细胞活性CH25H抑制剂，并建立了一种适用于发现和验证未来CH25H抑制剂的筛选方法。

**研究背景与现存问题**
胆固醇25-羟化酶（CH25H）是二铁脂质氧化酶（diiron lipid oxidase）家族的成员，通过非血红素二铁催化中心将胆固醇转化为25-羟基胆固醇（25HC）。25HC作为氧甾醇，在转录信号传导（如LXR通路）和膜流动性调节中发挥关键作用。CH25H作为干扰素刺激基因，在炎症环境下表达上调，其活性不仅参与抗病毒免疫，还通过促进TLR4信号和NFκB激活驱动促炎效应，从而在骨关节炎、阿尔茨海默病、tau蛋白病、神经炎症、肠纤维化及血管损伤等多种疾病的病理进程中扮演重要角色。尽管CH25H敲除小鼠展现出保护性表型，但目前尚无靶向CH25H的小分子抑制剂，这限制了对其在疾病模型中的治疗潜力进行评估。CH25H作为一种内质网（ER）驻留的跨膜蛋白，依赖细胞色素b5类蛋白维持催化循环，纯化研究极为困难，导致该酶长期缺乏化学探针。因此，开发首批细胞活性抑制剂并建立可推广的筛选方法具有重要的科学和转化意义。

**关键技术方法**
研究人员构建了基于气相色谱-质谱（GCMS）的细胞活性测定法，通过瞬时转染Ch25h-FLAG（标签蛋白）至HEK293T细胞，定量检测25HC水平。采用两个聚焦文库进行筛选：一个包含42种已知铁配位基团的小分子，另一个由78种甾醇或类固醇类似物组成。通过Western blot评估蛋白表达稳定性，利用CellTiter-Glo法监测细胞活力（ATP水平），并采用RT-qPCR量化下游转录靶点Hmgcs1的表达以验证功能抑制。选择性评估通过对二铁脂质氧化酶SC4MOL（MSMO1）和SC5D的底物进行GC-MS定量分析完成。

**研究结果**
**1. 建立并验证Ch25h过表达GCMS测定法**
通过转染小鼠Ch25h-FLAG至HEK293T细胞，GCMS检测到25HC显著产生，而催化失活突变体（H242Q/H243Q）无产物，证明测定法的特异性。时间曲线显示24小时孵育后25HC水平最高，且人类CH25H同样适用。此外，已有靶向其他二铁脂质氧化酶的抑制剂（如SC-26196、CP-24879、MGI-39）在10 μM浓度下不影响25HC产生，表明现有化合物无法作为抑制CH25H的有效起点。

**2. 筛选铁配位化合物库发现Ciclopirox和Phenanthroline**
对42种含铁配位基团的小分子进行单浓度筛选（10 μM），以80%抑制率为阈值，鉴定出Ciclopirox和phenanthroline两个阳性化合物。剂量反应实验显示，Ciclopirox的EC₅₀约为2 μM，phenanthroline略低，两者均无细胞毒性（胆固醇和ATP水平不变），且在不影响Ch25h蛋白表达浓度下完全抑制人CH25H。Ciclopirox为FDA批准的含N-羟基吡啶酮结构的抗真菌剂，phenanthroline是二价金属常用配体，两者疏水性除铁配位基团外可能促进与CH25H跨膜疏水活性位点的相互作用。

**3. 筛选甾醇类似物库发现U73343**
对78种含甾烷或类固醇结构的分子进行单浓度筛选，仅U73343呈现>90%抑制。剂量验证显示EC₅₀约1 μM，无细胞毒性（浓度>10 μM才出现），且在10 μM以下不改变CH25H蛋白表达。U73343为磷脂酶C抑制剂U73142的无活性类似物，其氨基类固醇结构（分子量466 Da，log D=3.3，CNS MPO评分3.5）为后续优化提供了合理理化性质基础。

**4. 选择性评估与转录响应验证**
选择性分析中，Ciclopirox和phenanthroline部分抑制SC4MOL（MSMO1）并强烈抑制SC5D酶活性，而U73343在10 μM浓度下对两者无抑制作用，显示出对CH25H的高度选择性。转录响应实验中，在CHO细胞中瞬时表达Ch25h-FLAG足以抑制Hmgcs1表达，催化失活QQ突变体无效；补充纯化25HC同样抑制Hmgcs1。Ciclopirox以剂量依赖方式恢复Hmgcs1表达，证实其可阻断CH25H依赖的转录效应。

**总结讨论与结论**
二铁脂质氧化酶家族12个成员中仅少数具有小分子抑制剂，而已有抑制剂（靶向FADS2、SC5D）对CH25H无效，强调了开发特异性探针的必要性。铁配位化合物中仅低比例能有效抑制CH25H，可能与分子疏水性及铁配位基团呈现方式有关。U73343凭借对SC4MOL和SC5D无交叉抑制的选择性，以及合理的药物化学性质，成为最具前景的先导化合物。研究结论为：这项工作确立了首批细胞活性的CH25H抑制剂，并建立了一种基于GCMS的筛选方法，适用于未来CH25H抑制剂的发现与验证。论文发表在《ACS Chemical Biology》。