新测序甲壳动物基因组编码的神经肽多样性揭示其在取食过程中的信号作用

《ACS Chemical Neuroscience》：Neuropeptide Diversity Encoded in Newly Sequenced Crustacean Genomes Reveals Signaling Roles during Feeding

　　

神经肽（Neuropeptide）是化学结构多样的信号分子，可调控生理与行为，但因基因组注释稀疏，许多物种缺乏神经肽组（Neuropeptidome）表征。研究人员整合基因组序列信息与神经肽组学方法，解析两种常用甲壳动物模型——蓝蟹（Callinectes sapidus）与黄道蟹（Cancer borealis）的神经肽组。利用经整理的多物种前体数据库进行tBLASTn比对、信号肽（Signal peptide）检测及计算机（in silico）加工预测，在两物种基因组中预测出逾23,000条推定肽段，含多条具成熟神经肽特征序列。基于质谱（Mass Spectrometry, MS）的分析为众多预测肽段提供实验佐证，并揭示显著化学多样性，包括蓝蟹中新型抑卵变位素B（Allatostatin B, AST?B）和C（AST?C）异构体、类胰岛素样肽（Insulin?like peptide, ILP）B链样异构体，以及黄道蟹中首次报道的natalisin肽。值得注意的是，研究人员观察到一种非典型前体（Prohormone）架构：单个前激素原编码两个不同神经肽家族，提示此前未被认识的神经肽共包装与信号传递模式。此外，借助取食扰动模型，研究人员发现胸神经节（Thoracic Ganglion, TG）、汇合神经节（Commissural Ganglion, CoG）及围心器（Pericardial Organs, POs）中新鉴定肽段丰度具组织特异性差异，符合功能性神经内分泌作用。综上，本研究拓展了已知甲壳动物神经肽库，为比较肽生物学提供资源，并为在新测序物种中发现内源性肽信号分子建立了基于基因组的框架。

论文解读：《新测序甲壳动物基因组编码的神经肽多样性揭示其在取食过程中的信号作用》

研究背景与立项依据

神经肽（Neuropeptide，神经元分泌的关键信号分子）在调节生理和行为中起核心作用，部分成员如胰岛素（Insulin）和胰高血糖素样肽?1（Glucagon?Like Peptide?1, GLP?1）已成为重要药物靶标。然而由于共调节（Comodulation，两种及以上神经肽协同实现共同功能）复杂性及缺乏系统的基因组注释，多数物种的神经肽组仍属未知。甲壳动物特别是蓝蟹（Callinectes sapidus）和黄道蟹（Cancer borealis，Jonah crab），因其胃臼神经节（Stomatogastric Nervous System, STNS，约30个神经元）结构简单，是解析神经肽驱动过程（如取食相关的胃磨和幽门节律）的经典无脊椎动物模型。这两物种的全基因组分别直至2021年和2024年才发表，此前神经肽研究受限于转录组和de novo质谱测序，无法全面获取未表达于所取组织的潜在肽段。基因组水平预测不受取样条件限制，可提供完整的肽编码潜能。因此研究人员开展本研究，利用新发布基因组通过in silico预测结合实验验证，系统界定两物种神经肽组并探究其在取食中的功能意义。该论文发表于《ACS Chemical Neuroscience》。

主要关键技术方法

研究人员选取两经典甲壳动物模型——蓝蟹（Callinectes sapidus）和黄道蟹（Cancer borealis）。从UniProt构建多物种甲壳动物神经肽前体（Precursor）查询库；采用tBLASTn将查询序列比对至两物种基因组（GCA_020233015.1和GCA_041682235.1），筛选E?value<0.001且序列相似度≥50%的hit；用SignalP 6.0识别含信号肽（置信≥0.70）的候选序列；用NeuroPred按单/双碱性残基切割位点进行in silico加工预测推定成熟肽。质谱（LC?MS/MS）分析脑、汇合神经节（Commissural Ganglion, CoG）、围心器（Pericardial Organs, POs）、胸神经节（Thoracic Ganglion, TG）及窦腺（Sinus Glands, SGs）提取的神经肽，数据库检索采用EndoGenius并允许C端酰胺化、Met氧化、N端焦谷氨酸（pyro?Glu）等可变修饰。取食实验设喂食30 min后组与未喂食对照组，肽段定量经总离子流（Total Ion Current, TIC）归一化，取食/未取食比值以log?计算。另用MotifQuest进行保守基序（Motif）挖掘，WebLogo可视化切割位点侧翼序列保守性，Clustal Omega多序列比对评估基序相似性。

研究结果

Prediction of Putative Neuropeptides（推定神经肽的预测）

研究人员经tBLASTn比对、信号肽过滤及NeuroPred切割预测，在C. borealis中获得14,569条推定肽（源自少量已注释前体基因），C. sapidus中获得8,892条推定肽。按成熟神经肽判定标准——N/C端具单/双碱性切割位点、C端酰胺化家族需Gly?X?(Arg/Lys)?模式、基序保守性及与已发表序列比对——筛选出成熟肽段列表。首次在C. borealis中鉴定到natalisin肽，其前体含信号肽并编码多个酰胺化与非酰胺化肽，C端具典型Gly前置双碱性切割。信号肽长度分布两物种相似（9–49残基），切割位点以双碱性（Lys?Arg/KR、Arg?Arg/RR）为主，亦见单碱性切割。将成熟前体回贴基因组：C. borealis中36个成熟肽映射至4个前体基因分属4条染色体（natalisin前体编码16肽，AST?B前体编码18肽）；C. sapidus中16个成熟肽映射至6个基因分布于5条染色体，蜕皮触发激素（Ecdysis?Triggering Hormone, ETH）家族最丰富（5个成熟肽）。

Isoform Detection via Mass Spectrometry（通过质谱检测异构体）

为实验验证in silico预测，研究人员对两物种神经组织进行LC?MS/MS并将鉴定肽回贴至对应前体。MS检测到多个新型异构体：C. borealis AST?B前体中重复出现QGSWGKR四肽，延伸出已知成熟序列NNWSKFQGSWamide等，并首次报道AGWSS^LWGAWamide这一AST?B家族可能新异构体；同前体还含TPDDTPEHGLQ^GSER、GEEIQ^AAED、S^TNWSSLRGA^A等AST?B家族异构体，而含QGSW/GAW基序肽段对应natalisin家族——即单个前体同时编码AST?B与natalisin两个不同神经肽家族，C. sapidus中RYamide推定前体也存在类似共编码RFamide与RYamide现象。C. sapidus corazonin同源前体中鉴定LANELNRVCK片段，上下文推演出类胰岛素样肽（Insulin?Like Peptide, ILP）B链异构体及ILP前体相关肽（Precursor?Related Peptide, PRP）异构体，半胱氨酸保留提示功能保守。AST?C前体中也观测到保守新异构体。

Motif Evaluation of Putative Peptides（推定肽段的基序评估）

用MotifQuest挖掘预测肽保守基序并与已知库比对。C. sapidus中重现CYFNPISCF（AST?C）、FGXRL（焦激肽/Pyrokinin）、YEXD/YDDD（CHH酰胺化型）、GASR/PSRA/QGLG（CPRP）等已知基序；C. borealis中检出FLGMR/FYGXR/LGXR（速激肽/Tachykinin）、WPPS/YEED/GSLP（CHHamide）、FYSQRY/GGXR（RYamide）。C. sapidus预测中出现高频基序GSDES（108次），扩展为可变基序GXXGSDES；其余高丰度基序两物种均有列出。模糊多序列比对显示预测与已知基序相似性中心约50%，证实预测可靠性。

Global Perspective on Neuropeptide Identifications and Potential Functional Roles in Feeding（神经肽鉴定的全局视角及其在取食中的潜在功能角色）

各组织中TG检出的肽鉴定数显著高于脑和窦腺。用新建预测库比对取食扰动模型（喂食30 min vs 未喂对照），在CoG、PO、TG三组织中见肽丰度差异：HSNSRGSERamide（脂动素/Adipokinetic hormone相关）、QRLQWLR（AST?B）、RSSRQamide（RFamide相关）在PO中降低、TG中升高；pGlu?VFEDRamide（pGlu＝焦谷氨酸，由N端Gln环化而来）呈相反趋势（PO升高、TG降低）。此反向变化符合PO（连STNS）与TG（连脑）的组织特异性神经内分泌角色。全局MS检索确认大量预测肽存在于实测数据集，表明基于基因组的无偏预测可深化对富脂TG等少探知组织的肽组成认识。此外，首次在C. borealis发现natalisin并观察到其与AST?B共编码于同一前体，提示单一前体编码不同神经肽家族或是被低估的共信号传递机制。

讨论与结论总结

研究人员通过多物种神经肽前体库、基因组tBLASTn比对、SignalP信号肽识别及NeuroPred切割预测，首次从蓝蟹与黄道蟹新测序基因组构建了含逾23,000推定肽（含大量成熟序列、新家族及异构体）的神经肽组数据库，并经LC?MS/MS实验验证。核心发现包括：发现C. borealis中natalisin肽及C. sapidus中新型AST?B/C、类ILP?B链异构体；首次报道甲壳动物中单个前激素原共编码natalisin与AST?B两个不同神经肽家族之非典型前体架构，暗示新的共包装与协同信号机制；取食模型显示特定新鉴定肽在PO与TG呈组织特异性反向丰度变化，支持其在取食相关神经内分泌调控中的作用。该研究扩展了甲壳动物已知神经肽谱，为比较肽生物学提供资源，并建立了一套适用于其他新测序无脊椎动物的基因组驱动神经肽发现框架。