PAX3-FOXO1通过其乙酰化的内在无序区接触BRD4

《Biochemistry》：PAX3-FOXO1 Contacts BRD4 through Its Acetylated Intrinsically Disordered Region

　　

转录因子的内在无序区（IDRs）常是翻译后修饰（PTMs）的高频发生位点，这些修饰可通过包括蛋白质-蛋白质相互作用在内的多种机制介导调控。在驱动肺泡型横纹肌肉瘤的融合致癌蛋白PAX3-FOXO1中，FOXO1内在无序区（IDR）内一段富含赖氨酸的区域可发生乙酰化，从而导致蛋白稳定性增强及转录活性升高。研究人员在本研究中利用¹³C直接检测核磁共振（NMR）波谱技术对该体系中的乙酰化进行表征，并鉴定出一个对应于内源性FOXO1第233位赖氨酸的新型乙酰化位点。既往对内源性FOXO1 DNA结合结构域的结构表征显示，局部结构似乎会阻止该位点发生乙酰化，这提示该位点在融合蛋白背景下变为暴露状态。此外，研究人员证实，溴结构域及超末端结构域蛋白BRD4的第一溴结构域可结合这一目标乙酰化区域，且该相互作用可被溴结构域及超末端结构域抑制剂JQ1所抑制。这些发现为既往关于BRD4与PAX3-FOXO1在ARMS超增强子（superenhancers）处共定位的观察提供了分子机制层面的细节，也进一步丰富了关于BRD4如何接触与癌症相关转录因子的研究文献，这对于理解溴结构域及超末端结构域抑制剂在肿瘤治疗中的应用具有潜在意义。

该研究发表于《Biochemistry》，聚焦于肺泡型横纹肌肉瘤（ARMS）关键融合致癌蛋白PAX3-FOXO1的分子调控机制。研究背景在于：转录因子的内在无序区（IDR，指缺乏稳定三维折叠、但具有重要调控功能的蛋白区域）常富集翻译后修饰（PTMs），其中赖氨酸乙酰化可显著改变蛋白稳定性、DNA结合能力及转录调控活性。FOXO1羧基末端IDR中的赖氨酸乙酰化早已被证实参与靶基因调节，而在ARMS中，这一来源于FOXO1的IDR被染色体易位带入PAX3-FOXO1融合蛋白，并与PAX3来源的DNA结合结构域拼接，成为驱动疾病发生的重要组成部分。已有研究表明，PAX3-FOXO1可在远端增强子和超增强子处募集BRD4、MED1和p300等转录共激活因子，并且BET抑制剂可削弱其稳定性，但PAX3-FOXO1是否通过其乙酰化赖氨酸与BRD4发生直接接触、具体由BRD4哪个溴结构域介导、乙酰化位点如何分布，此前并无严格的分子层面证据。因此，开展该研究对于理解融合致癌转录因子的异常激活机制，以及阐明BET抑制剂的潜在治疗基础具有重要意义。

为解决上述问题，研究人员选择FOXO1 226–270区段作为研究对象，该区段位于FOXO1羧基末端IDR中，保留于PAX3-FOXO1融合蛋白内，并含多个可能的p300乙酰化位点。研究的核心目标包括：解析该区段在体外的乙酰化位点谱；判定新暴露位点是否出现于融合背景相关的无序环境；检测乙酰化后FOXO1来源IDR是否直接结合BRD4及其具体溴结构域；评估JQ1是否能够竞争性阻断这一相互作用。研究结果表明，p300可在该区段诱导K233、K245和K248发生乙酰化，其中K233为此前在内源性FOXO1中未被报道的新位点；该位点在天然FOXO1中邻近叉头结构域（forkhead domain）的有序区域，而在融合蛋白背景下所对应的区段呈无序状态，因而更易暴露并接受乙酰化。进一步的结合分析显示，BRD4与该乙酰化区域之间确实存在直接相互作用，而且这一相互作用特异性经由BRD4第一溴结构域（BD1）介导，第二溴结构域（BD2）在本研究构建体和条件下未观察到明显结合；JQ1可使结合相关化学位移变化恢复至游离状态，说明该结合依赖BRD4经典乙酰赖氨酸识别口袋。上述结论从分子层面解释了为何BRD4与PAX3-FOXO1可在ARMS超增强子区域协同存在，并提示融合事件不仅改变了转录因子的结构组成，还可能通过暴露新的可乙酰化位点，重塑其与表观遗传读取蛋白（epigenetic reader）的接触方式。

研究所采用的关键技术方法主要包括以下几类：首先，研究人员构建并纯化FOXO1 226–270片段、BRD4 BD1/BD2及p300赖氨酸乙酰转移酶（KAT）结构域，建立体外重组体系；其次，利用¹³C直接检测核磁共振（NMR）结合¹³C/¹⁵N同位素标记与¹³C乙酰辅酶A，对FOXO1-IDR的主链和乙酰化赖氨酸进行残基分辨率赋值与乙酰化位点判定；再次，采用MALDI-TOF质谱验证乙酰化程度和乙酰化状态分布；最后，通过选择性NMR结合实验以及[¹H,¹⁵N]-HSQC检测BRD4溴结构域与乙酰化FOXO1肽段的相互作用，并以JQ1进行竞争抑制验证。本研究未采用患者队列，而是基于体外纯化蛋白和合成肽体系开展机制研究。

在“Rationale and Approach”部分，研究人员首先阐明研究设计逻辑：聚焦于FOXO1羧基末端IDR中邻近叉头结构域、已知可发生多位点赖氨酸乙酰化且在PAX3-FOXO1中被保留的片段，作为BRD4潜在结合界面。由于该区域具有内在无序特征，传统结构方法难以准确解析，研究人员因此采用更适合无序区研究的¹³C直接检测NMR，在溶液环境中以氨基酸分辨率追踪乙酰化和构象变化。该部分的核心结论是：所选策略能够同时兼顾无序蛋白的谱图分辨率、主链全覆盖性以及对翻译后修饰的直接观测能力，为后续位点鉴定和结合研究奠定方法学基础。

在“Identification of In Vitro FOXO1 IDR Acetylation Events by p300”部分，研究人员完成了未修饰和乙酰化FOXO1-IDR的主链¹³C/¹⁵N共振赋值，并通过MALDI-TOF证实样品以双乙酰化和三乙酰化状态为主。比较乙酰化前后的[¹³C′,¹⁵N]-CON谱后发现，K233、K245与K248邻近区域出现最显著的化学位移扰动（CSP）。进一步利用3D (H)CCCON-IPAP分析赖氨酸侧链脂肪族碳化学位移，研究人员观察到K233、K245和K248的¹³C_δ信号由约29 ppm下移至约30.5 ppm，这是赖氨酸乙酰化的特征性标志；相比之下，K262与K265未见明显乙酰化证据。综合峰强度分析，K233接近化学计量性乙酰化，K245与K248分别表现为部分乙酰化，而K262和K265基本不被p300修饰。该部分据此得出结论：在体外体系中，p300对FOXO1来源IDR的乙酰化并非均匀发生，而是偏向K233、K245、K248三个位点。

随后，研究人员进一步讨论乙酰化位点环境差异及K233位点的特殊性。借助选择性观测乙酰赖氨酸酰胺键的[¹³C′,¹⁵N]-CON-Kac-IPAP实验，研究人员发现乙酰赖氨酸信号并非完全简并，提示各乙酰化位点即便处于同一无序区，仍具有细微而可分辨的局部化学环境。这意味着不同乙酰化位点可能在后续蛋白识别中呈现不同选择性。针对K233这一与既往文献不一致的新位点，研究人员构建K233R突变体，通过主链和侧链NMR信号变化确认原先赋值确属K233。结合既往资料可知，K233在天然FOXO1中位于forkhead结构域的wing 1附近，处于更有序的结构约束中；而在本研究所用的融合相关片段背景下，该位点位于无序环境，因此对p300更可及。二级结构倾向分析未见K233附近存在持续性二级结构，也未见乙酰化诱导明显二级结构重塑，说明增强转录活性的机制并非通过局部折叠变化实现，而更可能与新的分子识别事件相关。

在“BRD4 BD1 Binds Acetylated FOXO1 IDR”部分，研究人员直接检验乙酰化FOXO1-IDR与BRD4两个溴结构域的结合能力。利用1H起始的[¹³C′,¹³C_ali]-C_aliCO-Kac-IPAP实验，研究人员观察到乙酰化FOXO1-IDR在加入BRD4 BD1后，其乙酰赖氨酸相关信号发生清晰分裂和位移变化，提示直接结合发生；当进一步加入JQ1后，这些变化消失并回归游离状态，证明该相互作用依赖BRD4溴结构域的乙酰赖氨酸结合口袋。相反，在相同条件下加入BRD4 BD2并未引起明显谱图变化。为验证这并非构建体异常所致，研究人员进一步使用合成的FOXO1和FOXO3短肽，通过[¹H,¹⁵N]-HSQC证实这些肽段均可与BRD4 BD1和BD2相互作用，但FOXO1肽与BD2结合表现较弱，说明在完整无序区序列背景和当前浓度条件下，BD1更易检测到稳定结合。该部分的核心结论是：PAX3-FOXO1中FOXO1来源乙酰化无序区可直接接触BRD4，且在本研究体系中主要由BD1介导。

在同一部分的后续分析中，研究人员也审慎指出了结合模式解析的局限。由于样品中同时存在双乙酰化和三乙酰化状态，结合后出现的两个共振峰究竟代表不同乙酰化位点被区分，还是不同乙酰化状态分子被区分，现有数据尚无法完全判定。为探索位点特异性贡献，研究人员构建K233R、K245R、K248R、K262R和K265R五种单点突变体，并对其进行统一批次p300乙酰化，再通过NMR和MALDI-TOF分析。结果显示，所有乙酰化突变体仍可与BRD4 BD1结合，但各突变体的乙酰化状态分布发生明显变化，尤其部分样品保留未乙酰化峰并伴随高乙酰化状态增加，提示赖氨酸周围序列背景显著影响p300底物识别与加工过程。这些结果虽然未能完全拆解每个位点对BRD4结合的单独贡献，但明确揭示了序列背景、乙酰化模式和BRD4识别之间存在复杂耦联关系，也为未来更精细的机制研究提供方向。

讨论部分的核心在于：该研究将PAX3-FOXO1与BRD4在ARMS中的共定位现象推进到直接分子互作层面，证明FOXO1来源IDR中的乙酰赖氨酸是BRD4识别的直接基础，并强调融合蛋白背景可通过暴露原本在天然蛋白中受结构限制的位点，创造新的调控界面。研究还指出，虽然内源性FOXO1与BRD4的功能关联已有报道，但缺乏直接结合证据；本研究发现的K233新位点以及BD1特异性结合，为解释融合蛋白在超增强子环境中异常稳定和高转录活化提供了更具体的结构生化框架。与此同时，作者也明确承认目前仍无法完全区分多个乙酰化位点和不同乙酰化状态对BRD4结合的各自贡献，因此有必要在更大构建体、跨融合连接区的体系以及更精细位点控制条件下进一步研究。

研究结论部分可译为：研究人员报道了FOXO1内在无序区一部分的主链¹³C/¹⁵N共振赋值，该区段在天然FOXO1中对应226–270位残基，在PAX3-FOXO1中对应407–451位残基，并存在于致癌融合蛋白PAX3-FOXO1内；这一融合蛋白已知携带可增强转录活性的乙酰化标记。与既往关于天然FOXO1乙酰化赖氨酸的报道相比，PAX3-FOXO1在K233这一新位点发生乙酰化。此外，BRD4可与PAX3-FOXO1在活性超增强子处共定位，此前已有观点推测BRD4可能通过直接相互作用稳定乙酰化的PAX3-FOXO1。值得注意的是，BRD4尚未被证明可直接结合内源性FOXO1。造成这一现象的原因可能包括ARMS患者来源细胞系中超增强子处BRD4丰度升高，也不能排除内源性forkhead结构域遮蔽乙酰赖氨酸结合位点，或K233乙酰化有助于募集溴结构域的可能性。研究人员在本研究中证明，PAX3-FOXO1与BRD4之间的相互作用由FOXO1贡献的IDR中的乙酰赖氨酸介导，并且特异性通过BRD4第一溴结构域发生，该过程可被高选择性抑制剂JQ1中断。总体而言，这些结果强调了对乙酰化转录因子与BRD4之间相互作用进行分子层面表征的必要性。