半乳寡糖(Galacto-Oligosaccharides, GOS)重塑黏蛋白O-连接聚糖(O-Glycan)谱以增强生命早期小肠屏障发育

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Galacto-Oligosaccharides Reshape Mucin O-Glycan Profiles to Enhance Small Intestinal Barrier Development in Early Life

　　

黏液屏障对出生后肠道稳态至关重要，但半乳寡糖(Galacto-Oligosaccharides, GOS)是否调控黏蛋白糖基化尚不清楚。本研究以仔猪为模型，采用超高效液相色谱(UPLC)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、免疫荧光、凝集素染色及组织形态学分析，探讨生命早期GOS补充对黏蛋白O-连接聚糖(O-Glycan)及肠屏障发育的影响。GOS补充显著增加了早期空肠绒毛宽度、黏膜厚度、杯状细胞数目及MUC2表达。糖组学分析显示GOS选择性重塑黏蛋白O-Glycan谱，表现为Core 1/3及α2,3-唾液酸化聚糖升高，Core 2/4及α2,6-唾液酸化结构减少。伴随C1GALT1、GALNTs、ST3GALs上调及ST6GALNACs和唾液酸酶(neuraminidases)下调。凝集素染色证实α2,3-唾液酸化增强、α2,6-唾液酸化减弱。结果表明膳食GOS促进肠屏障发育并选择性调节黏蛋白O-Glycan组成与唾液酸化，为益生元支持生命早期肠道健康提供了新机制见解。

论文解读：半乳寡糖(GOS)重塑黏蛋白O-连接聚糖谱以增强生命早期小肠屏障发育

研究背景与目的

在现代集约化养猪生产中，新生及哺乳仔猪因消化与免疫系统未成熟而易发生肠道功能障碍。肠黏液层作为分隔肠腔微生物与上pi皮的第一道防线，其完整性高度依赖杯状细胞分泌的黏蛋白（主要是MUC2）及其O-连接聚糖（O-Glycan，O-连接寡糖）的糖基化修饰。黏蛋白O-Glycan不仅决定黏液理化性质，还介导宿主—微生物互作。目前关于生命早期营养干预能否调控仔猪黏蛋白型O-糖基化进而促进黏液屏障发育仍不明确。半乳寡糖（Galacto-Oligosaccharides, GOS）是乳糖衍生的非消化性寡糖，已知可选择性促进有益菌生长；新证据表明GOS可能直接与宿主糖基化通路交互。因此，研究人员以哺乳仔猪为模型，探究生命早期GOS补充对肠屏障功能及空肠黏蛋白MUC2之O-Glycan谱的调控作用及分子机制，为早期营养干预改善肠道健康提供理论依据。本研究发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。

主要关键技术方法

研究人员选用同胎同日龄健康初生二元杂交仔猪（Landrace × Large White × Duroc），设对照组（CON，灌服生理盐水）与GOS组（灌服GOS溶液 1 g/kg/天，自出生第1天至第21天断奶），于21日龄及49日龄采集空肠组织与黏液。主要技术手段包括：①组织形态学与组织化学——H&E与过碘酸-希夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）染色定量绒毛高度/宽度、隐窝深度、杯状细胞数；②免疫荧光检测MUC2蛋白及紧密连接(Tight Junction, TJ)相关蛋白定位；③凝集素染色——以MAL II（识别α2,3-连接唾液酸）和SNA（识别α2,6-连接唾液酸）标记唾液酸化模式，并共染MUC2分析共定位；④黏蛋白O-Glycan提取与β-消除释放，经Supelclean ENVI-Carb柱纯化、2-氨基苯甲酰胺（2-Aminobenzamide, 2-AB）荧光衍生化后，用超高效液相色谱（UPLC）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行糖组学鉴定与相对定量；⑤实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测MUC2、T-合酶（C1GALT1/C1GALT1C1）、多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶（GALNT家族）、α2,3/α2,6-唾液酸转移酶（ST3GAL/ST6GALNAC家族）及神经氨酸酶（NEU家族）mRNA表达；⑥Western Blot验证C1GALT1、GALNT12、NEU1蛋白水平；⑦Spearman相关分析评估糖基转移酶—糖链结构—黏膜形态参数间关联。

研究结果

3.1. Intestinal Morphology and Mucin Expression

研究人员发现GOS补充显著提高21日龄仔猪空肠绒毛宽度、黏膜层厚度及杯状细胞数目（P < 0.01），49日龄时绒毛宽度与黏膜厚度仍显著高于对照，表明早期GOS干预对黏膜架构有持续效应。免疫荧光与RT-qPCR显示GOS组空肠MUC2蛋白及mRNA表达均显著上调（P < 0.01或P < 0.05），且紧密连接相关基因ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA在21日龄显著升高（P < 0.05），说明GOS促进杯状细胞分化与MUC2分泌，并增强上皮紧密连接完整性。

3.2. Composition and Abundance of Intestinal Mucin O-Glycans

UPLC-MALDI-TOF-MS鉴定出21日龄19种、49日龄17种O-Glycan结构。GOS引起特异性重塑：21日龄Core 1型中m/z 526、793聚糖相对丰度升高，m/z 607、688降低；Core 2（m/z 870）、Core 3（m/z 544、867）及Core 4（m/z 930、1153）部分结构丰度下降。49日龄Core 1中m/z 793、941升高，m/z 898降低；Core 4中m/z 930升高、m/z 1153降低，表明部分GOS诱导糖重塑模式在断奶后仍部分保留。

3.3. GOS Selectively Remodels Mucin O-Glycan Core Composition and Sialic Acid Linkage Patterns

虽然总岩藻糖化、唾液酸化水平无组间差异，但21日龄时空肠Core 1 O-Glycan与α2,3-唾液酸化O-Glycan比例显著升高，Core 2/4及α2,6-唾液酸化O-Glycan比例降低（P < 0.01或P < 0.05）。49日龄主要表现为α2,3-唾液酸化升高与α2,6-唾液酸化降低（P < 0.05），Core分布不再受显著影响，提示GOS对糖基核心组成调控具发育阶段依赖性。

3.4. Relative Expression of Glycosyltransferases

分子机制上，21日龄GOS组空肠黏膜C1GALT1、分子伴侣C1GALT1C1及多个GALNTs（GALNT1、GALNT2、GALNT6、GALNT7）显著上调（P < 0.01或P < 0.05），支持Core 1合成增强。唾液酸转移酶呈连接特异性调控：ST3GAL1/2/3/4/6上调，ST6GALNAC1/2/4下调（P < 0.01或P < 0.05），与α2,3-增多、α2,6-减少吻合。神经氨酸酶（NEU1–4）mRNA显著下调（P < 0.01或P < 0.05），Western Blot中C1GALT1、GALNT12升高、NEU1降低，与转录趋势一致。

3.5. Levels of Sialylation and Sialylated MUC2 in the Intestinal Mucosa

凝集素染色验证GOS组空肠α2,3-唾液酸荧光强度增强、α2,6-唾液酸信号减弱（P < 0.01）。MUC2与凝集素共定位分析显示GOS显著增加α2,3-唾液酸化MUC2、减少α2,6-唾液酸化MUC2（P < 0.01），表明GOS特异性重编程主要分泌型黏蛋白MUC2的糖基化模式。

3.6. Correlation Analysis among Glycosyltransferases, O-Glycan Structures, and Mucosal Barrier Parameters

Spearman相关分析表明Core 1 O-Glycan及α2,3-唾液酸化与MUC2表达、杯状细胞数、黏膜厚度呈正相关；Core 2/4 O-Glycan及α2,6-唾液酸化呈负相关。C1GALT1、ST3GAL1与其对应糖链结构强正相关，证实糖基转移酶转录水平驱动O-Glycan重塑并与黏液屏障发育协调关联。

讨论与结论总结（翻译结论部分）

综上所述，本研究表明哺乳期补充GOS可深刻重塑仔猪小肠黏蛋白型O-Glycan谱，形成更成熟且具功能性保护的黏液屏障。GOS选择性上调Core 1相关糖基转移酶（如GALNT1、C1GALT1）与α2,3-唾液酸转移酶（ST3GALs），同时下调α2,6-唾液酸转移酶（ST6GALNACs）及神经氨酸酶（NEUs），促使O-Glycan结构向α2,3-唾液酸化偏移。这些分子变化伴随心MUC2表达增加、杯状细胞密度升高及黏膜架构改善，共同表明上皮防御与微生物共生得到增强。上述机制见解拓展了当前对GOS作用的认识——超越菌群调节，突显其作为生命早期干预策略促进新生动物肠道发育与抗逆性的潜力。